Lægemiddelstyrelsens Center for Lægemiddelvurdering (CDE) har i sine retningslinjer for genterapiprodukter klart angivet, at det er nødvendigt at kontrollere mængden af DNA-rester og størrelsen af resterende fragmenter, og anbefalet, at størrelsen af DNA-restfragmenter kontrolleres under 200 bp så meget som muligt. Derfor er fjernelse af resterende nukleinsyrer i biofarmaceutiske midler ekstremt vigtig. Med den stigende kompleksitet af produktionsprocesser står effektiv fjernelse af resterende nukleinsyrer i miljøer med højt saltindhold over for adskillige nye udfordringer:
- Under oprensningsprocessen af AAV-vira anvendes ofte buffere med højere saltkoncentrationer (200-500 mM) for at forbedre virusgenvinding. Konventionelle nukleaser viser imidlertid et signifikant fald i aktivitet med stigende saltkoncentration. Hvis renseeffekten skal forbedres ved at øge mængden af enzym og inkubationstid, vil det øge omkostningerne kraftigt
- Værts-DNA eksisterer normalt i form af kromatin og indkapsles let af proteiner, hvilket gør DNA'et utilgængeligt. I miljøer med højt saltindhold kan nukleinsyrer og proteiner effektivt adskilles og dermed bedre fjerne resterende nukleinsyrer
- Virusvektorer såsom AAV kan aggregere på grund af elektrostatiske interaktioner, og denne aggregering er mere tilbøjelig til at forekomme under lav ionstyrke og resterende DNA-betingelser, hvilket fører til reduceret stabilitet og påvirker udbyttet. Øget saltkoncentration kan effektivt reducere AAV-viruspartikelaggregation, hvilket forbedrer genvindingshastigheden af AAV-viruspartikler
Salt Active UltraNuclease (salttolerant bredspektret nuklease) er en rekombinant ikke-specifik endonuklease afledt af marine mikroorganismer. Sammenlignet med UltraNuclease udviser den optimal aktivitet ved 500 mM saltkoncentration og kan effektivt fjerne nukleinsyrekontamination selv i miljøer med højt saltindhold.
Produktapplikationsscenarier
- Fjernelse af resterende nukleinsyrer i biologiske lægemidler: Under produktionen af biologiske lægemidler, såsom vira, vacciner og proteiner, kan UltraNuclease tilsættes for at nedbryde resterende nukleinsyrer. Dette trin øger ikke kun udbyttet af vira, men reducerer også væsentligt indholdet af resterende nukleinsyrer, hvorved lægemidlernes sikkerhed og effektivitet sikres.
- Viskositetsreduktion: Ved at nedbryde nukleinsyrer reduceres viskositeten af cellelysater, hvilket letter filtrerings-/ultrafiltreringsprocesser under oprensningen af celle-afledte partikler såsom vira, AAV-vektorer og inklusionslegemer.
- Forbedret opløsning og restitution: I ELISA, todimensionel elektroforese og immunoblotting-analyser, forbedrer det opløsning og restitution.
- Forebyggelse af celleaggregation: UltraNuclease kan effektivt forhindre aggregering af humane perifere mononukleære blodceller (PBMC'er).
Produktets ydeevnetest
Effekten af højt saltmiljø på enzymaktivitet (Na+)
For at matche brugen af Salt Active UltraNuclease har Yeasen også selvstændigt udviklet et specifikt detektionskit til Salt Active UltraNuclease, som effektivt kan detektere enzymrester og reducere risici. Salt Active UltraNuclease ELISA-kittet blev udviklet og produceret i overensstemmelse med retningslinjerne for validering af analytiske metoder <9101> i den kinesiske farmakopé fra 2020, der nøje overholder nøglekravene til multiparametertest (lineært område, specificitet, nøjagtighed, præcision, følsomhed, accelereret stabilitet osv.).
Til dette formål har Yeasen Biotech udviklet et ELISA-kit til påvisning af Salt Active UltraNuclease. Sættet bruger princippet om dobbelt antistof sandwich enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) til at detektere den resterende mængde af Salt Active UltraNuclease. Standard- og testprøverne af Salt Active UltraNuclease sættes til den enzymcoatede plade, der er præcoatet med anti-Salt Active UltraNuclease-antistof (36703-A). Derefter tilsættes det fortyndede biotin-mærkede nuklease-detektionsantistof (36703-C), efterfulgt af Streptavidin-HRP (SA-HRP) (36703-D). Dette danner et antistof + antigen + antistof-biotin + SA-HRP kompleks. Efter vask af pladen tilsættes TMB-substratopløsning (36703-H) til farveudvikling. Under katalyse af HRP-enzym ændres TMB fra farveløst til blåt og bliver til sidst gult under virkningen af stopopløsning (36703-I). Intensiteten af den gule farve er direkte proportional med mængden af højsalt-tolerant universal nuklease detekteret i prøven.
Den eksperimentelle proces til påvisning af resterende saltaktiv ultranuklease ved hjælp af saltaktiv ultranuklease ELISA-kittet.
Karakteristika for UltraNuclease og Salt Active UltraNuclease ELISA kit:
Regulativ overholdelse: Fuldt valideret i henhold til regulatoriske krav, valideringsrapporter er tilgængelige;
Kvalitetssikring: Alle råmaterialer til sættet er uafhængigt udviklet, hvilket sikrer kontrollerbar kvalitet;
Høj følsomhed: Kvantitativ grænse så lav som 23 pg/ml;
Høj præcision: Høj intra-batch repeterbarhed og lav inter-batch variabilitet;
Stærk specificitet: Ingen krydsreaktivitet med andre manipulerede celleproteiner
Præstationsparametre
| Produktparametre | tilfreds |
| Assay tid | 3,5 timer |
| Assay princip | To-site immunoenzymetrisk assay |
| Signalforstærkning | Biotin-streptavidin system |
| Detektionsbølgelængde | 450nm og 630nm |
| Følsomhed | 0,024 ng/ml |
| Detektionsområde | 0.047 ng/ml~3 ng/ml |
| Detektionsobjekt | Salt Active UltraNuclease |
| Gældende instrument | Molekylære enheder: M- og i-serien |
| Anvendelse | Påvisning af resterende nuklease i oprensningsprocesser af celle- og genterapi og rekombinante adeno-associerede virusvacciner |
Produktdata:
Reagenssæt standardkurve:
Specificitet
Krydsreaktiviteten mellem Salt Active UltraNuclease-antistoffet og de syv proteiner i sættet blev evalueret ved at bruge dette kit til at påvise proteinerne tilsat i de syv processer. En positiv kontrol (PC-0,047 ng/ml) og en negativ kontrol (NC-0 ng/ml) blev sat op.
Resultaterne viste, at proteinet tilsat i de 7 processer var tæt på den negative kontrol (NC-0 ng/ml), påvisningskoncentrationen var lavere end grænsen for kvantificering af dette kit (0,047 ng/ml), og ingen krydsreaktion var observeret.
Sgedde Recovery rate:
Tilføj tre koncentrationsstandarder (dvs. Std1 3 ng/ml, Std3 0,75 ng/ml og Std5 0,188 ng/ml) i lige store forhold til de to prøver leveret af kunden til spidsgenvindingseksperimentet. Resultaterne viser, at spidsgenvindingsraterne alle er mellem 80 % og 120 %. Spidsgenvindingsgrad % = (målt værdi af spiked prøve - målt værdi af spiked prøve) / teoretisk værdi (mængde tilsat standard) * 100%.
| Eksempelnavn | Testkoncentration af Salt Active UltraNuclease（ng/mL） | Mængde af standard (ng/mL) | Testresultat (ng/ml) | Spike-genvindingsrate (%) |
| TS1 | 0,04 | 3 | 1,71 | 114,00 % |
| 0,75 | 0,347 | 92,53 % | ||
| 0,188 | 0,085 | 90,43 % | ||
| TS2 | 0,08 | 3 | 1,772 | 118,13 % |
| 0,75 | 0,405 | 108,00 % | ||
| 0,188 | 0,104 | 110,64 % |
Nøjagtighed
1) Gentagelighed
Tre Salt Active UltraNuclease-standardprodukter med høj, medium og lav koncentration blev udvalgt til gentagne forsøg. I det samme eksperiment blev prøverne af hver koncentration testet 10 gange, og CV% < 10%.
| In-batch forskel | |||
| Teoretisk koncentration (ng/mL) | Antal gentagelser | Gennemsnit (ng/ml) | Variationskoefficient CV (%) |
| 1.5 | 10 | 1.444 | 2,97 % |
| 0,188 | 10 | 0,196 | 2,27 % |
| 0,047 | 10 | 0,051 | 2,56 % |
2) Mellempræcision
Forskellige batches af kits blev brugt til 3 eksperimenter, hvert eksperiment blev udført med 3 koncentrationer af høj, medium og lav, og hver koncentration blev gentaget 10 gange. I alt 30 data blev opnået fra hvert koncentrationspunkt, og CV% af hver koncentration var mindre end 15%.
| Batch forskel | |||
| Teoretisk koncentration (ng/mL) | Antal eksperimenter | Gennemsnit (ng/ml) | Variationskoefficient CV (%) |
| 1.5 | 3 | 1,423 | 5,70 % |
| 0,188 | 3 | 0,212 | 5,59 % |
| 0,047 | 3 | 0,059 | 6,82 % |
Produktinformation
| Produktnavn | Produkt antal | Produktspecifikationer |
| 20159ES25/50/60/80/90 | 25KU/50KU/100KU/1MU/5MU | |
| 36703ES96 | 96T |
Andre relaterede produkter
| Produktnavn | Produktnummer | Produktspecifikationer |
| 20157ES25/50/60/80/90 | 25KU/50KU/100KU/1MU/5MU | |
| 36701ES59 | 96T |