Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronisch-entzündliche Gelenkerkrankung, die durch anhaltende Synovitis, systemische Entzündungen sowie Knochen- und Knorpelerosion gekennzeichnet ist und letztendlich zu Gelenkversteifung und -deformierung führen kann. RA-Tiermodelle werden häufig zur Erforschung der Pathogenese und therapeutischer Methoden eingesetzt. Verschiedene Tiermodelle wurden zur Untersuchung der RA-Ätiologie, Pathogenese und Einflussfaktoren sowie zur Erforschung neuer therapeutischer Ziele und zur Evaluierung neuer Therapien etabliert.

RA-Tiermodelle lassen sich grob in zwei Kategorien unterteilen: induzierte und transgene Modelle. Zu den häufigsten induzierten Modellen gehören die Kollagen-induzierte Arthritis (CIA) und die Adjuvans-induzierte Arthritis (AA), während transgene Mausmodelle u. a. humane TNF-α-transgene Modelle umfassen.

Freunds Adjuvans wurde in den 1940er Jahren von Jules Freund erfunden. Es handelt sich um eine Öl-in-Wasser-Antigenemulsion, die durch Mischen einer wässrigen Antigenlösung mit einem Öl und Zugabe eines Emulgators hergestellt wird. Es ist das am häufigsten verwendete Adjuvans in Tierversuchen.

Freundsches Adjuvans wird in komplettes Freundsches Adjuvans (CFA) mit Mycobacterium tuberculosis und inkomplettes Freundsches Adjuvans (IFA) ohne Mycobacterium tuberculosis unterteilt. Sie werden hauptsächlich zur Induktion von Kollagen-induzierter Arthritis (CIA) und Adjuvans-induzierter Arthritis (AA) bei Mäusen verwendet.

Abbildung 1. Rheumatoide Arthritis beim Menschen

Abbildung 2. Rheumatoide Arthritis bei Mäusen

1 Kollageninduzierte Arthritis (CIA) (nur als Referenz)

1.1 Mausmodell

Das CIA-Modell ist eines der am häufigsten verwendeten RA-Mausmodelle. Die Immunisierung von Tieren mit heterologem Typ-II-Kollagen kann eine Autoimmunreaktion gegen Typ-II-Kollagen im Gelenkknorpel auslösen, die zu einer polyartikulären peripheren Arthritis führt.

Methode zur Modellkonstruktion: Rinderkollagen Typ II (CII) wird über Nacht bei 4 °C in Eisessig gelöst. Anschließend wird hitzeabgetötetes Mycobacterium tuberculosis (BCG) in flüssiges Paraffin gegeben, um komplettes Freundsches Adjuvans (CFA) herzustellen. Die beiden werden gemischt und emulgiert, um eine Emulsion von Kollagen Typ II herzustellen. Diese Emulsion wird der Maus subkutan injiziert (0,1–0,2 ml) an der Schwanzwurzel, um eine Entzündung hervorzurufen. Am 21. Tag nach der ersten Immunisierung wird eine Auffrischungsinjektion von 0,1–0,2 ml der Kollagentyp-II-Emulsion intraperitoneal verabreicht. Nach der ersten Immunisierung zeigen die Mäuse lokale Entzündungsreaktionen, die innerhalb von etwa einer Woche abheilen. Nach der Adjuvans entwickeln die Mäuse ab dem 24. Tag Gelenkschwellungen, die sich von den Hinterpfoten über die Vorderpfoten bis zum Schwanz ausbreiten.

1.2 Rattenmodell

Modellkonstruktion: Rinderkollagen Typ II (CII) wird zu gleichen Teilen mit inkomplettem Freund'schen Adjuvans (IFA) gemischt und emulgiert. Am ersten Tag erhalten die Ratten intradermale Injektionen an mehreren Stellen, eine Woche später eine intraperitoneale Auffrischung. Das Modell wird innerhalb von 3–7 Tagen nach der zweiten Immunisierung erhalten. Sieben Tage nach der Sensibilisierung sind die Sprunggelenke leicht geschwollen und gerötet, und die Symptome verschlimmern sich nach 3 Wochen, wobei Hautulzerationen möglich sind. Nach 5–6 Wochen verschlimmern sich die pathologischen Veränderungen weiter, wobei Gelenkknorpel und subchondraler Knochen durch Pannus erodiert und zerstört werden.

2 Adjuvans-induzierte Arthritis (AA) (nur als Referenz)

Das AA-Modell ist das am häufigsten verwendete RA-Modell bei Ratten und umfasst zwei Typen: Inkomplettes Freund-Adjuvans (IFA) und komplettes Freund-Adjuvans (CFA).

Modellkonstruktion: Ratten werden intradermal injiziert, um eine Entzündung auszulösen. Das Modell zeigt in der Regel 10–20 Tage nach der Induktion anhaltende Entzündungssymptome, mit einem Höhepunkt nach etwa 20 Tagen.Die Entzündung betrifft vor allem das Sprunggelenk und kann sich auf die Fußballen und den gesamten Fuß auswirken. Die Symptome der Gelenkschwellung ähneln denen klinischer RA-Patienten, es können jedoch auch Immunschwächephänomene auftreten.

3 Schritte zur Modellierung von Kollagen-induzierter Arthritis (CIA) (nur als Referenz)

• Rinderkollagen Typ II (CII) wird in einer Eisessiglösung mit einer Konzentration von 2 mg/ml gelöst und über Nacht bei 4 °C aufbewahrt.
• Inkomplettes Freundsches Adjuvans wird mit hitzeabgetötetem Mycobacterium tuberculosis bis zu einer Konzentration von 2–5 mg/ml ergänzt. Die Konzentration von Mycobacterium tuberculosis im kompletten Freundschen Adjuvans 60718ES von Yisheng Biology beträgt weniger als 10 mg/ml.
• Eine Essigsäurelösung aus Rinderkollagen Typ II wird mit komplettem Freund-Adjuvans in gleichen Mengen gemischt und emulgiert.
• Jede Versuchsmaus erhält 4–6 subkutane Injektionen in den Rücken, insgesamt 0,1–0,2 ml.
• Drei Wochen später wird unvollständiges Freundsches Adjuvans mit einer Essigsäurelösung aus Rinderkollagen Typ II in gleichen Mengen gemischt und emulgiert. Anschließend werden jeder Maus 3–5 subkutane Injektionen in die Schwanzwurzel verabreicht, insgesamt 0,1–0,2 ml.

4 Schritte zur Modellierung von Adjuvans-induzierter Arthritis (AA) (nur als Referenz)

• Bereiten Sie die relevanten Reagenzien vor und beachten Sie dabei die Zusammensetzung der Versuchs- und Kontrollgruppen.
• Beobachtung und Dokumentation: Im Allgemeinen zeigen mehr als 80 % der Mäuse 7–12 Tage nach der zweiten Immunisierung Arthritissymptome. Die klinischen Symptome werden anhand der Rötung und Aktivität des Mausgelenks bewertet. Die Beobachtungen werden vor dem Experiment sowie am 3., 5., 7. und 12. Tag nach dem Experiment dokumentiert. Die Bewertungskriterien sind wie folgt:

Tabelle 1 Bewertungskriterien

SKern	SSymptom
0	Die Aktivität war normal, ohne Anzeichen von Erythem und Schwellung.
1	Die Aktivität war normal, lediglich die Haut war gerötet und es gab keine nennenswerten Schwellungen.
2	Die Aktivität ist leicht beeinträchtigt, die Krallen, Fußballen oder das Kniegelenk sind gerötet.
3	Aktivität beeinträchtigt, Pfotenzehen und Gelenke leicht deformiert und geschwollen.
4	Die Bewegung ist blockiert, die Zehen und Gelenke sind stark gerötet und geschwollen, steif oder deformiert.

• Mausmessung: Verwenden Sie ein Mauspfotenvolumenmessgerät, um das Gelenkvolumen der Hinterbeine der Maus vor und nach dem Experiment zu messen. Messen Sie das Volumen etwa 5 mm unterhalb des Kniegelenks der Hinterbeine jeder Maus dreimal und notieren Sie den Durchschnittswert. Das Volumen ist proportional zum Grad der Gelenkrötung und -schwellung. Die Messung erfolgt alle drei Tage.
• Pathologische Untersuchung: Mäuse aus der Versuchs- und Kontrollgruppe entnehmen, häuten, mit 4 % Formaldehyd über 48 Stunden fixieren, mit 5 % Salpetersäure 2 Stunden entkalken, in Xylol tauchen und in Paraffin einbetten.Machen Sie 6 mm dicke Schnitte, färben Sie sie mit HE und beobachten Sie sie mit einem herkömmlichen optischen Mikroskop, um einen Bewertungsstandard für die pathologische Diagnose festzulegen.

5 Experimentelle Fallbilder (Auszug aus der Literatur)