1.Vorwort
Makrophagen sind große Phagozyten, die sich von Monozyten im Blut unterscheiden. Sie kommen in fast allen Geweben vor, insbesondere in solchen, die häufig mit der Außenwelt in Kontakt stehen, wie Haut, Lunge und Darm. Makrophagen spielen eine wichtige Rolle bei vielen biologischen Prozessen wie der menschlichen Immunabwehr, Entzündungsreaktionen, Gewebereparatur, Immunregulierung und Krankheitsentstehung.
Primäre menschliche Makrophagen lassen sich nur schwer in ausreichender Zahl aus Geweben isolieren und vermehren sich in Kulturen nicht. Aus Monozyten gewonnene Makrophagen stellen eine hervorragende Alternative dar, da Monozyten im menschlichen Blut leicht in großen Mengen gewonnen werden können und in vitro in Makrophagen differenziert werden können.
2.Biologische Funktionen von Makrophagen
- Phagozytose
Makrophagen erkennen und verschlingen Krankheitserreger und abgestorbene Zelltrümmer durch Rezeptoren auf ihrer Oberfläche. Dieser Prozess hilft nicht nur bei der Beseitigung von Infektionen, sondern verhindert auch, dass sich diese Substanzen im Körper ansammeln, was zu Entzündungen oder anderen Problemen führen könnte.
- Abwehr gegen Krankheitserreger
Makrophagen bekämpfen Krankheitserreger, indem sie Chemikalien produzieren, die Mikroorganismen abtöten, wie etwa reaktiven Sauerstoff und Stickoxide, sowie Zytokine und Chemokine, die Entzündungsreaktionen regulieren.
- Entzündungsregulierung
Makrophagen spielen bei Entzündungsreaktionen eine komplexe Rolle. Sie können Entzündungen nicht nur fördern, indem sie entzündungsfördernde Zytokine wie Tumornekrosefaktor Alpha (TNF-α) und Interleukin 1 (IL-1) freisetzen, sondern auch hemmen, indem sie entzündungshemmende Zytokine wie IL-10 und TGF-β produzieren.
- Gewebereparatur und -rekonstruktion
Nach einer Entzündungsreaktion helfen Makrophagen bei der Reparatur und Regeneration von Gewebe, indem sie verschiedene Wachstumsfaktoren absondern. Sie beseitigen die Überreste der Schädigung und fördern gleichzeitig die Bildung neuen Gewebes.
- Immunmodulation
Makrophagen fördern spezifische Immunreaktionen, indem sie T-Zellen Antigene präsentieren. Gleichzeitig regulieren sie andere Komponenten des Immunsystems, indem sie verschiedene Zytokine ausschütten, beispielsweise die Aktivität von T-Zellen und B-Zellen.
- Beziehung zu Krankheiten
Makrophagen spielen eine wichtige Rolle bei der Entstehung zahlreicher Erkrankungen, darunter Infektionskrankheiten, Autoimmunerkrankungen, Tumoren und chronisch-entzündliche Erkrankungen wie Arteriosklerose.
3. Klassifizierung von Makrophagen
Je nach Aktivierungszustand und Funktion können Makrophagen in zwei Hauptkategorien unterteilt werden: M1 und M2. Diese beiden Subtypen spielen unterschiedliche Rollen bei der Immunantwort und der Entzündungsregulierung.
M1-Makrophagen
M1-Makrophagen werden hauptsächlich durch Zytokine wie Interferon gamma (IFN-γ) und Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α) stimuliert und haben entzündungsfördernde Eigenschaften. Sie haben eine starke antimikrobielle Aktivität, können Sauerstoffradikale und Entzündungsfaktoren produzieren und sind an der Abtötung und Beseitigung pathogener Mikroorganismen wie Bakterien und Viren beteiligt.
M1-Makrophagen sind an der Immunabwehr und Entzündungsreaktion des Körpers beteiligt, fördern die Infiltration von Entzündungs- und Immunzellen, helfen bei der Beseitigung infizierter und geschädigter Gewebe und fördern die Entstehung und Aufrechterhaltung immunologischer Entzündungsreaktionen.
M2-Makrophagen
M2-Makrophagen werden hauptsächlich durch Zytokine wie Interleukin-4 (IL-4) und Interleukin-13 (IL-13) stimuliert und haben entzündungshemmende und reparierende Eigenschaften. Sie sind an Gewebereparatur- und Regenerationsprozessen beteiligt und fördern entzündungshemmende Reaktionen und die Immunregulierung.
M2-Makrophagen spielen im Spätstadium von Entzündungen und der Gewebereparatur eine wichtige Rolle, fördern die Auflösung der Entzündung und die Gewebereparatur, regulieren das Gleichgewicht der Immunreaktionen und fördern die Geweberegeneration und -reparatur.
Abbildung 1. Zusammenfassung der wichtigsten Polarisationszustände aktivierter Makrophagen [1]
4. Isolierung, Kultur und Differenzierung von Makrophagen in vitro
4.1 Trennverfahren
- Isolierung aus peripherem Blut
Isolierung von Monozyten: Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) werden mittels Dichtegradientenzentrifugation (z. B. Ficoll-Paque) isoliert. Die Blutprobe wird auf die obere Ficoll-Schicht gegeben, und nach der Zentrifugation befinden sich die Monozyten zwischen der Plasma- und der Ficoll-Schicht.
Isolierung von Makrophagen: Nachdem die Monozyten aus PBMCs isoliert wurden, können die mononukleären Vorläuferzellen durch Kunststoffadhäsion weiter isoliert werden. Monozyten werden mehrere Stunden lang in Kunststoffkulturschalen kultiviert, nicht anhaftende Zellen werden entfernt und die verbleibenden anhaftenden Zellen sind hauptsächlich mononukleäre Vorläuferzellen.
- Isolierung aus Geweben
Gewebeproben werden durch mechanische und/oder enzymatische Behandlung (z. B. Kollagenase und DNase) in Einzelzellsuspensionen zerlegt. Nichtzielzellen werden durch Dichtegradientenzentrifugation oder negative Selektion (mithilfe von Antikörpern und magnetischen Kügelchen) entfernt und Makrophagen gesammelt.
4.2 Kulturmethode
Häufig verwendete Kulturmedien sind RPMI 1640 oder IMDM, die normalerweise mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 1 % Penicillin/Streptomycin und den erforderlichen Wachstumsfaktoren ergänzt werden müssen. Die Kulturbedingungen sind normalerweise in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2
4.3 Differenzierungsinduktionsmethode
- Differenzierung aus mononukleären Vorläuferzellen
Verwendung von M-CSF: Fügen Sie dem Kulturmedium Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) hinzu, üblicherweise in einer Konzentration von 20–50 ng/ml, und setzen Sie die Kultivierung für 7–10 Tage fort, um die Differenzierung mononukleärer Vorläuferzellen in Makrophagen zu induzieren.
Verwendung von GM-CSF: Der Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) kann ebenfalls die Differenzierung von Makrophagen induzieren, insbesondere die Tendenz zur Produktion von M1-Makrophagen (entzündungsfördernd).
- Weitere Regulierung von Phänotyp und Funktion
M1-Makrophagen: kann durch Zugabe von IFN-γ (Interferon-γ) und LPS (Lipopolysaccharid) zum Kulturmedium induziert werden.
M2-Makrophagen: kann durch die Zugabe entzündungshemmender Zytokine wie IL-4 und IL-13 herbeigeführt werden.
Mit diesen Methoden können Forscher die verschiedenen biologischen Funktionen von Makrophagen und ihr Verhalten unter pathologischen Bedingungen in vitro untersuchen. Die spezifischen Betriebsbedingungen jedes Schritts (wie Zelldichte, Kulturzeit, Konzentration hinzugefügter Faktoren usw.) müssen möglicherweise je nach dem spezifischen Zweck des Experiments optimiert werden.
Tabelle 1.Makrophagenkultur und Induktionsbedingungen
| Zellquelle | Kulturmedium | Erste Ergänzungen | M1 Polarisation | M2 Polarisation |
| THP-1-Zelle | RPMI 1640 | 100 ng/ml PMA | 20 ng/ml IFN-γ 100 ng/ml LPS | 20 ng/ml IL-4 20 ng/ml IL-13 |
| Monozyten | RPMI 1640 | M1: 50 ng/ml GM-CSF M2: 50 ng/ml M-CSF | 10 ng/ml LPS 50 ng/ml IFN-γ | M2a: 20 ng/ml IL-4 M2b: IgG+LPS M2c: 20 ng/ml TGF-β1 oder 10 ng/ml IL-10 |
| MPfeil | IMDM | 10-50 ng/ml M-CSF | 100 ng/ml LPS (50ng/ml IFN-γ können hinzugefügt werden) | 10 ng/ml IL-4 (10 ng/ml IL-13 können hinzugefügt werden) |
| RAW264.7 Zelle | DMEM | / | 100 ng/ml LPS | 20 ng/ml IL-4 (20 ng/ml IL-10 kann hinzugefügt werden） |
5.Analysedaten
YEASEN bietet eine Reihe von HiActive®-Zytokinprodukten mit hoher Aktivität im Zusammenhang mit der Makrophagenkultur zur Unterstützung der Makrophagenforschung an.
HiActive® Hochaktive Zytokine:Die biologische Aktivität jedes Zytokins wurde überprüft, um die hohe Aktivität des Zytokins sicherzustellen.
Daten zur Aktivitätsüberprüfung:
Rekombinantes Maus-M-CSF-Protein
Figur 1. Gemessen in einem Zellproliferationstest mit M‑NFS‑60 Maus myeloische Leukämie-Lymphoblastenzellen. Die ED50 für diesen Effekt beträgt typischerweise 16,74 -25,83 ng/ml.
Rekombinant Maus GM-CSF Protein
Figur 2.Der ED50 wie durch einen Zellproliferationstest mit murinen FDC-P1-Zellen bestimmt, beträgt 2,79–12,84 pg/ml.
Rekombinant Menschliches IL-10 Protein
Figur 3. Der ED50-Wert wurde durch einen Zellproliferationstest bestimmt, bei dem murinen MC/9-Zellen beträgt weniger als 0,1 ng/mL, was einer spezifischen Aktivität von > 1,0×10 entspricht7 IE/mg.
Verwandte Produkte
| Einstufung | Spezies | Katze | Spezifikation |
| G-CSF | Menschlich | 2 μg/10 μg/ 50 μg/ 100 μg | |
| Maus | 2 μg/ 10 μg/50 μg/100 μg/500 μg | ||
|
M-CSF | Menschlich | 10 μg/100 μg/500 μg | |
| Maus | 10 μg/100 μg/ 500 μg | ||
|
GM-CSF | Menschlich | 5 μg/50 μg/100 μg/ 500 μg | |
| Maus | 10 μg/100 μg/ 500 μg | ||
| IFN-γ | Menschlich | 20 μg/50 μg/ 100 μg/ 500 μg | |
| Maus | 5 μg/50 μg/ 100 μg/ 500 μg | ||
| IL-4 | Menschlich | 5 μg/50 μg/ 100 μg/ 500 μg | |
| Maus | 5 μg/ 100 μg/ 500 μg | ||
| IL-10 | Menschlich | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg | |
| Maus | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg | ||
| IL-13 | Menschlich | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg | |
| Maus | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg |
Verweise
[1]Atri C, Guerfali FZ, Laouini D.Rolle der menschlichen Makrophagenpolarisation bei Entzündungen während Infektionskrankheiten. Int J Mol Sci. 2018 Jun 19;19(6):1801.