1.Hintergrund von Laminin 521
Laminin 521 (LN521) ist ein wichtiges Zelladhäsionsprotein in der natürlichen Stammzellnische und eine Matrix für die Kultivierung und Expansion menschlicher embryonaler (hES) und induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPSC). LN521 bindet an Zelloberflächenrezeptoren und aktiviert Zellsignalwege, was zur Produktion funktionellerer Zellen führt.
Laminin 521 reproduziert die biologisch relevante hPSC-Umgebung in vitro, fördert die Anheftung, hohe Überlebensrate und starke langfristige Selbsterneuerung von hPSC und ist ein wichtiges Matrixprotein, das das Stammzellwachstum unterstützt und die Stabilität der Struktur und Leistung der Basalmembran aufrechterhält. Laminin 521 ist auch eine der am häufigsten verwendeten nährstofffreien Kulturmatrizen. Darüber hinaus kann Laminin 521 eine effiziente Einzelzellpassage genetisch stabiler und pluripotenter Stammzellen ohne Zugabe von Apoptosehemmern erreichen. Die Zellen wachsen in einer gleichmäßigen Monoschicht, ohne dass Differenzierungsbereiche manuell entfernt werden müssen. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass LN521 das PSC-Wachstum über mehr als 10 Generationen ohne Anzeichen von Karyotyp-Anomalien unterstützen kann und die Fähigkeit von PSC aufrechterhält, sich in die drei Keimblätter der inneren, mittleren und äußeren Keimblätter zu differenzieren.
Abbildung 1. Struktur von Laminin 521 [1]
2. Laminin-Beschichtungsexperiment
2.1 Laminin 521 mit sterilem deionisiertem Wasser oder Wasser für Injektionszwecke auf 400 µg/ml vorbereiten. Es wird empfohlen, vor der Verwendung mit sterilem 1×DPBS (Ca++/Mg++) weiter auf 100 µg/ml zu verdünnen und dann mit sterilem DPBS (Ca++/Mg++) auf eine Arbeitskonzentration von 5-10 µg/ml zu verdünnen. Die Beschichtungskonzentration variiert je nach Art der kultivierten Zellen, und es wird empfohlen, das Versuchsprotokoll zu optimieren, um die optimale Beschichtungskonzentration für die Zellen zu bestimmen. Empfohlene Konzentrationen finden Sie in Tabelle 1.
Notiz: DPBS mit Ca2+ und Mg2+ sollte verwendet werden, da zweiwertige Kationen für die Proteinstruktur und -funktion wichtig sind. Die erforderliche Arbeitskonzentration von Laminin 521 hängt von den Zellen und der Anwendung ab. Wir empfehlen eine anfängliche Beschichtungskonzentration von 0,5 μg/cm2.
Tabelle 1. Empfohlene Volumina der Arbeitslösung aus rekombinantem humanem Laminin für verschiedene Kulturgefäße.
| Petrischale | Beschichtungskonzentration (μg/ml) | Zusätzliche Menge von LN521 | Zusatzbetrag von 1*DPBS | Gesamtvolumen |
| 6 gut | 5 | 50 μl/Vertiefung | 950 μl/Vertiefung | 1 ml/Vertiefung |
| 12 Brunnen | 5 | 25 μl/Vertiefung | 475 μl/Vertiefung | 0,5 ml/Vertiefung |
| 24 Brunnen | 5 | 15 μl/Vertiefung | 285 μl/Vertiefung | 0,3 ml/Vertiefung |
| 48 Brunnen | 5 | 7,5 μl/Vertiefung | 142,5 μl/Vertiefung | 150 μl/Vertiefung |
| 96 Brunnen | 5 | 3,5 μl/Vertiefung | 66.5 μl/Vertiefung | 70 μl/Vertiefung |
| 35mm Petrischale | 5 | 50 μl/Vertiefung | 950 μl/Vertiefung | 1 ml/Vertiefung |
| 60mm Petrischale | 5 | 100 μl/Vertiefung | 1900 μl/Vertiefung | 2 ml/Vertiefung |
| 100 mm Petrischale | 5 | 300 μl/Vertiefung | 5700 μl/Vertiefung | 6 ml/Vertiefung |
Das obige Volumen basiert auf einer Beschichtungskonzentration von 5 μg/ml.
2.2 Geben Sie das angegebene Volumen der Laminin-DPBS-Mischung in jede Vertiefung und schütteln Sie sie vorsichtig. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Oberfläche mit der Laminin-Beschichtungslösung bedeckt ist, da unbeschichtete Oberflächen kein Zellwachstum unterstützen.
2.3. Legen Sie die Platte in einen 37 °C heißen Inkubator und lassen Sie sie über Nacht inkubieren. Die Mindestinkubationszeit beträgt 2 Stunden, aber um ideale Zellkulturbedingungen zu schaffen, wird eine Inkubation über Nacht empfohlen. Achten Sie darauf, dass der Kulturbehälter nicht austrocknet, da dies LN521 inaktivieren würde.
2.4. Wenn die Zellen zur Aussaat bereit sind, saugen Sie die Laminin 521-Lösung ab.
3.iPSC-Kultur
3.1 Auftauen von iPSCs (am Beispiel einer 12-Well-Platte)
3.1.1 iPSCs aus flüssigem Stickstoff oder Trockeneis nehmen und 10 Sekunden lang in 37 °C warmem Wasser auftauen.
3.1.2 Sterilisieren Sie die Kryoröhrchen mit 75 % Alkohol und legen Sie sie auf eine Arbeitsfläche.
3.1.3 Übertragen Sie die Zellen in ein neues 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 9 ml DMEM-F12.
3.1.4 Zentrifugieren Sie das 15-ml-Zentrifugenröhrchen 5 Minuten lang bei 300 g bei Raumtemperatur.
3.1.5 Entsorgen Sie die Lamininlösung aus der beschichteten 12-Well-Platte.
3.1.6 Verwerfen Sie das Zellüberstand und resuspendieren Sie die iPSCs vorsichtig in 1 ml mTeSR-plus (enthält 10 µM Y-27632) und übertragen Sie sie in die beschichtete 12-Well-Platte. Schütteln Sie die Platte, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen, bis eine endgültige Zelldichte von 1×10^5 Zellen/Well erreicht ist, und lassen Sie sie 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Stellen Sie sicher, dass die Kultur innerhalb von 4–5 Tagen passagiert wird.
3.1.7 Geben Sie die Platte mit 12 Vertiefungen zur Inkubation zurück in den 37 °C warmen Inkubator.
3.1.8 Das Kulturmedium mit dem ROCK-Inhibitor sollte nach 12–16 Stunden entfernt und die Kultivierung im Medium ohne Inhibitor fortgesetzt werden.
Tabelle 2. Zellbesiedlungsdichte in verschiedenen Kulturgefäßen, Zellzahl bestimmt nach Zellwachstumsrate
| Zellkulturgefäße | 6 gut | 12 Brunnen | 24 Brunnen | 96 Brunnen |
| Handynummer | 2,5 ~ 3,5 × 105 | 6~8×104 | 3~4×104 | 0,5 ~ 1 × 104 |
3.2. iPSC-Passage-Protokoll
3.2.1 Den Kulturüberstand verwerfen und mit 1 ml PBS (Ca‑‑/Mg‑‑).
Notiz: Verwenden Sie PBS ohne Ca2+ und Mg2+, da zweiwertige Kationen einen negativen Effekt auf einige Dissoziationsenzyme haben.
3.2.2 Entsorgen Sie das PBS und fügen Sie 0,5 ml Gentle Cell Dissociation Reagent hinzu.6–8 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren oder unter dem Mikroskop beobachten, bis die Zellen nicht mehr an die Platte gebunden sind.
3.2.3 Fügen Sie ein gleiches Volumen DMEM-F12 hinzu, mischen Sie die Zellen vorsichtig, geben Sie sie bei Raumtemperatur in ein Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 300 g.
3.2.4 Bereiten Sie vor dem Passagieren der Zellen eine mit Laminin beschichtete 12-Well-Platte vor.
3.2.5 Den Überstand verwerfen und die Zellen in mTeSR‑plus‑Medium mit 10 µM Y‑27632.
3.2.6 Übertragen Sie die Zellen auf die vorbereitete, mit Laminin beschichtete 12-Well-Platte. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen, und lassen Sie sie 10 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur stehen.
3.2.7 Legen Sie die Platte mit 12 Vertiefungen in einen Inkubator mit 37 °C und inkubieren Sie sie.
Notiz: iPSCs differenzieren sich schnell und sterben ab, nachdem sie zu einer Monoschicht herangewachsen sind. Um Wachstum und Pluripotenz aufrechtzuerhalten, müssen sie passagiert werden, bevor sie konfluent sind.
3.3. Kryokonservierung von iPSC
3.3.1 Bereiten Sie das schonende Zelldissoziationsreagenz vor.
3.3.2 Führen Sie eine Zelltrennung entsprechend dem iPSC-Passageprotokoll durch und verwenden Sie die Zellorganellenzählung, um die Zelldichte vor der Kryokonservierung sicherzustellen.
3.3.3 Jedes Röhrchen mit Zellen sollte bei einer Zelldichte von 1-2×10^6 eingefroren werden. Befolgen Sie die Schritte der Zentrifugation und Entfernung des Zellkulturmediums im iPSC-Passageprotokoll. Resuspendieren Sie das isolierte iPSC-Pellet in einem geeigneten Volumen Kryokonservierungslösung
3.3.4 Geben Sie 1 ml des resuspendierten Zellkryokonservierungspellet in ein 1,5-ml-Kryokonservierungsröhrchen, führen Sie eine Programmkühlung durch und geben Sie es anschließend zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff um.
4.Wichtige Hinweise zur Lamininbeschichtung
4.1. Alle Schritte des Versuchsprotokolls müssen unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.
4.2. Vermeiden Sie, Laminin längere Zeit der Raumtemperatur auszusetzen.
4.3. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden
4.4. Nach dem Auftauen kann die unverdünnte Proteinstammlösung unter sterilen Bedingungen bei 2 bis 8 °C aufbewahrt werden und ist mindestens 3 Monate lang stabil lagerfähig.
5. Verwandte Produktinformationen
| Produktname | Katze# | Größe |
| 92602ES | 10μg/100μg/500μg/1mg |
6.Referenzen
[1]Pulido D, Briggs DC, Hua J, Hohenester E. Die kristallographische Analyse des kurzen Arms von Laminin β2 zeigt, wie die LF-Domäne in eine regelmäßige Anordnung von LE-Domänen eingefügt wird. Matrix Biol. 2017 Jan;57-58:204-212.