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Die Bindung von Fluorescein-dUTP an DNA mit Bruchstücken durch TdT-Transferase ist eine der gängigsten Methoden zur Erkennung von Apoptose. Auf diesem Prinzip basiert beispielsweise das In Situ Cell Death Kit von Roche. Die TdT-Transferase-Aktivität im Produkt beeinflusst direkt die Markierungseffizienz.
Derzeit verwenden mehr als 120 Forschungsgruppen dieses Produkt und haben zahlreiche englischsprachige Artikel in maßgeblichen Fachzeitschriften wie Theranostics und EMBO Molecular Medicine veröffentlicht.
Erkennungsmechanismus
Im Spätstadium der Apoptose führen Doppelstrangbrüche oder Einzelstrangbrüche der chromosomalen DNA zu einer großen Zahl klebriger 3-OH-Enden. Unter Einwirkung des Desoxyribonukleotid-Terminustransfers (TdT) wird fluoreszein-/enzymmarkiertes dUTP an das 3-terminale Ende der DNA gebunden, sodass die Apoptose durch Fluoreszenzerkennung nachgewiesen werden kann. Dies wird als Desoxyribonukleotid-Terminustransferase-vermittelte Nick-End-Markierung bezeichnet. Diese Methode heißt Terminal-Desoxynukleotidyl-Transferase-vermittelte Nick-End-Markierung (TUNEL) und das Prinzip ist in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der durch terminale Desoxynukleotidyltransferase vermittelten Nick-End-Markierung (TUNEL)
Produkteigenschaften
- Breites Anwendungsspektrum
Kann für in Paraffin eingebettete Gewebeschnitte, gefrorene Gewebeschnitte, kultivierte Zellen und aus Geweben isolierte Zellen verwendet werden.
- Hohe Nachweisempfindlichkeit
Es können sehr geringe Mengen apoptotischer Zellen nachgewiesen werden.
- Geringe Hintergrundstörungen
Hohes Signal-Rausch-Verhältnis.
- Beobachtungsvielseitigkeit
Fluoreszenzmikroskopische Beobachtung, Durchflussdetektion.
Datenpräsentation
1. Maus-Präadipozyten (3T3-L) Tunel-Assay
Abbildung 2: Nachweis der Apoptose von Präadipozyten 3T3-L bei Mäusen. Die erste Reihe stellt die Negativkontrolle dar, die zweite die Positivkontrolle. Nachweisreagenz: Kat.-Nr. 40306 TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC)
2. Tunnelerkennung von Paraffinschnittproben
Abbildung 3: LY3009120 allein oder in Kombination mit Vemurafenib und Obatoclax verzögerte Schilddrüsenkrebs in einem subkutanen Transplantattumormodell wirksam. IF = 8,8. Probentyp: in Paraffin eingebettetes Tumorgewebe (entnommen von Nacktmäusen). Nachweisreagenz: Kat.-Nr. 40307 TUNEL Apoptosis Detection Kit (Alexa Fluor 488).
3. Tunnelerkennung beim Zellcrawlen
Abbildung 4: Wirkung von Zinksulfat auf die Apoptose von Endothelzellen in verschiedenen Untergruppen. Probentyp: HUVEC (menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen). Nachweisreagenz: Kat.-Nr. 40308 TUNEL Apoptosis Detection Kit (Alexa Fluor 640)
4. Durchflusszytometrie zur Erkennung von Apoptose
Abbildung 5: PA-Behandlung kann das Auftreten von Apoptose während der Neuprogrammierung wirksam reduzieren. IF = 3,7. Probentyp: iPS-Zellen. Nachweisreagenz: Kat.-Nr. 40307 TUNEL Apoptosis Detection Kit (Alexa Fluor 488).
Literaturhinweise
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Häufig gestellte Fragen
Q: Auftreten unspezifischer Fluoreszenzmarkierungen?
1) Das Gewebe/die Zellen selbst weisen eine hohe Nuklease- oder Polymeraseaktivität auf, die leicht zur Entstehung unspezifischer Fluoreszenzmarkierungen führen kann, wie z. B. bei glatten Muskelzellen. Die Lösung besteht darin, die Zellen oder Gewebe unmittelbar nach der Entnahme zu fixieren und sie ausreichend zu fixieren, um zu verhindern, dass diese Enzyme falsche positive Ergebnisse verursachen.
2) Die Verwendung ungeeigneter Fixiermittel, wie z. B. einiger säurehaltiger Fixiermittel, führt zu falschen Positivergebnissen. Es wird ein frisch zubereitetes 4%iges neutrales Paraformaldehyd-Fixiermittel empfohlen.
3) Unspezifische Fluoreszenz kann auch auftreten, wenn die Reaktionszeit des TUNEL-Tests zu lang ist und die Zell- oder Gewebeoberfläche nicht feucht gehalten werden kann. Kontrollieren Sie die Reaktionszeit sorgfältig und stellen Sie sicher, dass die TUNEL-Testreaktionslösung die Probe gut bedeckt.
Q: Der Fluoreszenzhintergrund ist sehr hoch?
1) Zellen, die sich schnell teilen und vermehren und dabei ein hohes Transkriptionsniveau aufweisen, weisen manchmal auch DNA-Brüche im Zellkern auf.
2) Längere Einwirkung von Anregungslicht führt zu falsch positiven Ergebnissen.
Q: Geringe Etikettiereffizienz?
1) Die Fixierung mit Ethanol oder Methanol führt zu einer geringen Markierungseffizienz.
2) Die Fixierzeit ist zu lang, was zu einem zu hohen Vernetzungsgrad führt. Es ist ratsam, die Fixierzeit zu verkürzen.
3) Der Gewebeschnitt ist zu dick, wodurch die Fixierungswirkung unbefriedigend wird. Eine Kontrolle innerhalb von 10 μm ist besser.
(4) Fluoreszenzlöschung: Die Fluoreszenz wird bei 10 Minuten normalem Licht stark gelöscht. Die Lösung besteht darin, den Betrieb mit Licht zu vermeiden.
Produktdetails
Produktname | Artikelnr. | Spezifikation |
Annexin V-FITC/7-AAD Apoptose-Erkennungskit | 40311ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
40302ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
Annexin V-PE/7-AAD Apoptose-Erkennungskit | 40310ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
40303ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
Annexin V-YSFluor™ 488/7-AAD Apoptose-Erkennungskit | 40313ES60 | 100T |
40305ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
40304ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
Annexin V-YSFluor™ 647/7-AAD Apoptose-Erkennungskit | 40312ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
40306ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
40307ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
40308ES20/50/60 | 20T/50T/100T |