Mit der rasanten Entwicklung von PRotein SDie Proteinreinigungstechnologie spielt in der biologischen Forschung und der Biotechnologie eine immer wichtigere Rolle. Als Kerntechnik integriert sie die kodierenden Informationen des Zielproteins mithilfe gentechnischer Methoden in die Wirtszellen, um diese zur effizienten Proteinproduktion anzuregen. Anschließend werden eine Reihe anspruchsvoller In-vitro-Prozesse durchgeführt, um die hochreine Extraktion der Proteine zu erreichen. Die Proteinreinigung ermöglicht Wissenschaftlern die Isolierung einzelner Proteinarten, was für eingehende Studien zu Struktur und Funktion von Proteinen, die Entwicklung neuer Medikamente, die Diagnose von Krankheiten und die Förderung biotechnologischer Anwendungen von entscheidender Bedeutung ist. Diese Technologie gewährleistet nicht nur die Genauigkeit wissenschaftlicher Experimente, sondern treibt auch die Entwicklung der Biowissenschaften kontinuierlich voran.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Affinitätschromatographie[1]
Im Bereich des Protein-Engineerings dienen Fusions-Tags als leistungsstarkes Werkzeug, das durch die Bindung an Zielproteine verschiedene experimentelle Zwecke erleichtern kann. Die Funktionen gängiger Fusions-Tags sind in der folgenden Tabelle aufgeführt. Bleiben diese Markierungen jedoch nach Erfüllung ihrer anfänglichen Hilfsfunktionen auf den Fusionsproteinen, können sie sich nachteilig auf nachfolgende Experimente auswirken, beispielsweise durch Störungen immunologischer Tierversuche oder die biologische Aktivität der Proteine. Daher ist es entscheidend, diese unnötigen Fusionsmarkierungen zu entfernen, um die normale Funktion der Proteine und die Genauigkeit der Experimente zu gewährleisten.
Tabelle 1. Einführung in die Funktionen gängiger Fusions-Tags und enzymatischer Spaltungsmethoden
| Fusion-Tag | Größe (KDA) | Funktion | Gängige enzymatische Spaltungsmethoden |
| Sein | 0,84 | Nützlich für die Reinigung, kann lösliche Proteine/Einschlusskörperproteine reinigen. | TEV-Protease |
| Flagge | 1.01 | Das Zweckprotein fusionierte mit FVerzögerung Tag kann vom Antikörper gegen F erkannt werdenVerzögerung, so dass das Fusionsprotein mit FVerzögerung Das Tag kann mittels Western Blot, ELISA und anderen Methoden erkannt und identifiziert werden. | Enterokinase |
| GST | 26 | Verbessert die Proteinlöslichkeit, kann nur lösliche Proteine reinigen und toxische Proteine abschirmen. | Thrombin |
| MBP | 44,4 | Verbessern Sie die Proteinlöslichkeit und schütze toxische Proteine. | TEV-Protease |
| NusA | 55 | Verbessern Sie die Proteinlöslichkeit und schütze toxische Proteine. | Thrombin |
| SUMO | 11.2 | Verbessern Sie die Löslichkeit von Proteinen, fördern Sie Protein aus proteolytischen Hydrolyse und verbessern die Stabilität von Proteinen. | SUMO-Protease |
Heute freuen wir uns, Ihnen ein hochmodernes Produkt zur effizienten und präzisen Entfernung von Fusion-Tags vorstellen zu können - UCF.METM rTEV-Protease. Dank seines einfachen und leicht durchzuführenden experimentellen Verfahrens kann dieses Enzym problemlos unnötige Markierungen von Fusionsproteinen abspalten und so hochreine Zielproteine erhalten.
UCF.METM rTEV-Protease
Die TEV-Protease wird häufig zur Spaltung rekombinanter Proteinfusions-Tags eingesetzt und ist für ihre hohe Ortsspezifität bekannt. Sie erkennt die sieben Aminosäuren umfassende Sequenz EXXYXQ↓(G/S) präzise und spaltet präzise zwischen Glutamin und Glycin oder Serin. Die häufigste sieben Aminosäuren umfassende Sequenz ist Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓-Gly. Diese Spezifität gewährleistet die Genauigkeit und Effizienz der Proteinverarbeitung.
Abbildung 2. Schematische Darstellung des Wirkungsmechanismus der TEV-Protease[2]
UCF.METM rTEV-Protease ist eine gentechnisch veränderte und hochaufgereinigt rekombinante Protease. Sie behält nicht nur die volle funktionelle Aktivität des natürlichen TEV-Enzyms, sondern weist auch eine hervorragende Stabilität und Spezifität über einen größeren Temperaturbereich auf. Der Wirts-gDNA-Rest von tsein Produkt ist sehr niedrig, was eine höhere Schneideffizienz von Proteinfusions-Tags in praktischen Anwendungen gewährleistet und das Risiko der Einschleppung von Rückständen exogener Substanzen effektiv reduziert. UCF.METM Die rTEV-Protease zeigt optimale Aktivität bei pH 7,0 und 30 °C. Sie bleibt jedoch auch unter Bedingungen mit pH 6,0–8,5 und Temperaturen von 4–30 °C aktiv, um den unterschiedlichen Anforderungen der Proteinverarbeitung gerecht zu werden. Erwähnenswert ist, dass UCF.METM rTEV-Protease verfügt an ihrem N-Terminus über ein 6×His-Tag, das effizient durch Ni-NTA-Harz entfernt werden kann, wodurch eine präzise Reinigung des Zielproteins erreicht wird.
Leistungsanzeige
1. Hohe Spaltungseffizienz: Das Protein-Tag wird gründlicher abgespalten
Mit dem Fusionsprotein (3 μg), das das UCF.ME enthältTM rTEV-Protease-Spaltstelle als Substrat, UCF.METM rTEV-Protease wurde in Konzentrationen von 10, 5 bzw. 3 Einheiten zugegeben und die Reaktion 1 Stunde lang bei 30 °C durchgeführt. Der Spaltungseffekt wurde mittels Agarosegelelektrophorese nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigten, dass Yerleichtern's UCF.METM rTEV-Protease konnte das Substrat effizient spalten, wenn die Eingangsmenge mehr als 3 U betrug, mit einer Spaltungseffizienz von >90 %.
Abbildung 3. Überprüfung der Spaltungsaktivität von UCF.METM rTEV-Protease
2. Geringe gDNA-Rückstände des Wirts: Reduzieren Sie effektiv das Risiko der Einführung exogener Substanzrückstände
Durch Testen des Hosts (E. coli) gDNA-Reste in verschiedenen Chargen von UCF.METM rTEV Protease zeigten die Ergebnisse, dass der Wirts-gDNA-Rest von UCF.METM Die rTEV-Protease lag weit unter <1 Kopie/U.
Abbildung 4. Die Ergebnisse des Wirts-gDNA-Rests in UCF.METM rTEV-Protease
3. Breite Anwendungsbedingungen: Kann unterschiedliche Anforderungen an die Proteinverarbeitung erfüllen.
Durch die Überprüfung der Spaltungsaktivität von UCF.METM rTEV-Protease unter verschiedenen Bedingungen zeigten die Ergebnisse, dass UCF.METM Die rTEV-Protease zeigte unter Bedingungen von 4–30 °C eine starke Aktivität, wodurch sie den unterschiedlichen Anwendungsanforderungen der Kunden gerecht werden konnte.
| Reaktionszeit (H) | Spaltungsaktivität bei unterschiedlichen Temperaturen (%) | |||
| 4℃ | 16℃ | 21℃ | 30℃ | |
| 1 | 34 | 58 | 56 | 85 |
| 2 | 58 | 80 | 78 | 90 |
| 3 | 71 | 99 | 99 | 99 |
| 3.5 | 84 | 99 | 99 | 99 |
Yerleichternvon empfohlene Fusion Tag Cutting Protein Produkte
| Produkt Name | Produkt NUmber | |
| TEV Protease | UCF.METM rTEV-Protease | 20427ES |
| Enterokinase | Enterokinase, rekombinant | 20395ES |
| SUMO-Protease | SUMO-Protease | 20410ES |
| 3C-Protease | 3C-Protease | 20409ES |
Referenzen:
[1] Parikh I , Cuatrecasas P .Affinitätschromatographie[J].Vox Sanguinis, 1972, 23(1-2):141-146.DOI:10.1159/000466530.
[2] Paththamperuma C, Page R C. Fluoreszenz-Dequenching-Assay zur Bestimmung der Aktivität der TEV-Protease[J]. Analytische Biochemie, 2022, 659: 114954.