Mit der rasanten Entwicklung von Protein SIn der Wissenschaft spielt die Proteinreinigungstechnologie eine immer wichtigere Rolle im Bereich der biologischen Forschung und der Biotechnologiebranche. Als Kerntechnik beinhaltet sie die Integration der Codierungsinformationen des Zielproteins in die Wirtszellen durch gentechnische Methoden, sodass diese zur effizienten Produktion der erforderlichen Proteine angeregt werden können. Anschließend werden eine Reihe anspruchsvoller In-vitro-Arbeitsschritte durchgeführt, um eine hochreine Extraktion der Proteine zu erreichen. Durch die Proteinreinigung können Wissenschaftler einzelne Proteintypen isolieren, was für eingehende Studien zur Struktur und Funktion von Proteinen, die Entwicklung neuer Medikamente, die Krankheitsdiagnose und die Förderung der Anwendung der Biotechnologie von entscheidender Bedeutung ist. Diese Technologie gewährleistet nicht nur die Genauigkeit wissenschaftlicher Experimente, sondern treibt auch die Entwicklung der Biowissenschaften kontinuierlich voran.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Affinitätschromatographie[1]
Im Bereich des Protein-Engineerings sind Fusions-Tags ein leistungsfähiges Werkzeug, das durch die Bindung an die Zielproteine verschiedene experimentelle Zwecke erleichtern kann. Die Funktionen gängiger Fusions-Tags sind in der folgenden Tabelle als Referenz aufgeführt. Bleiben diese Markierungen jedoch nach Erfüllung ihrer anfänglichen Hilfsfunktionen auf den Fusionsproteinen, können sie nachteilige Auswirkungen auf nachfolgende Experimente haben, z. B. Störungen bei immunologischen Tierversuchen oder Auswirkungen auf die biologische Aktivität der Proteine. Daher ist es wichtig, diese unnötigen Fusionsmarkierungen zu entfernen, um die normale Funktion der Proteine und die Genauigkeit der Experimente sicherzustellen.
Tabelle 1. Einführung in die Funktionen gängiger Fusions-Tags und enzymatischer Spaltungsmethoden
| Fusion-Tag | Größe (KDA) | Funktion | Gängige enzymatische Spaltungsmethoden |
| Sein | 0,84 | Nützlich für die Reinigung, kann lösliche Proteine/Einschlusskörperproteine reinigen. | TEV-Protease |
| Flagge | 1.01 | Das mit F fusionierte ZweckproteinVerzögerung Tag kann vom Antikörper gegen F erkannt werdenVerzögerung, so dass das Fusionsprotein mit FVerzögerung Tag kann mittels Western Blot, ELISA und anderen Methoden erkannt und identifiziert werden. | Enterokinase |
| Mehrwertsteuer | 26 | Verbessert die Proteinlöslichkeit, kann nur lösliche Proteine reinigen und toxische Proteine abschirmen. | Thrombin |
| MBP | 44,4 | Verbessert die Proteinlöslichkeit und schirmen toxische Proteine ab. | TEV-Protease |
| NusA | 55 | Verbessert die Proteinlöslichkeit und schirmen toxische Proteine ab. | Thrombin |
| SUMO | 11.2 | Verbessern Sie die Löslichkeit von Proteinen, fördern Sie die Proteinproduktion aus proteolytischen Hydrolyse und verbessern die Stabilität von Proteinen. | SUMO-Protease |
Heute freuen wir uns, Ihnen ein hochmodernes Produkt zur effizienten und präzisen Entfernung von Fusion-Tags vorstellen zu können - UCF.METM rTEV-Protease. Mit seinem einfachen und leicht durchzuführenden experimentellen Verfahren kann dieses Enzym problemlos unnötige Markierungen von Fusionsproteinen abspalten und so hochreine Zielproteine erhalten.
UCF.METM rTEV-Protease
TEV-Protease ist eine Protease, die häufig zur Spaltung rekombinanter Proteinfusions-Tags verwendet wird und für ihre hohe Ortsspezifität bekannt ist. Sie erkennt genau die sieben Aminosäuren umfassende Sequenz EXXYXQ↓(G/S) und führt eine präzise Spaltung zwischen Glutamin und Glycin oder Serin durch. Die häufigste sieben Aminosäuren umfassende Sequenz ist Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓-Gly. Diese Spezifität gewährleistet die Genauigkeit und Effizienz des Proteinverarbeitungsverfahrens.
Abbildung 2. Schematische Darstellung des Wirkungsmechanismus der TEV-Protease[2]
UCF.METM rTEV-Protease ist eine gentechnisch veränderte und hoch gereinigte rekombinante Protease. Sie behält nicht nur die volle funktionelle Aktivität des natürlichen TEV-Enzyms, sondern weist auch eine hervorragende Stabilität und Spezifität über einen größeren Temperaturbereich auf. Der gDNA-Rest des Wirtes von tsein Produkt ist sehr niedrig, was eine höhere Schneideffizienz von Proteinfusions-Tags in der Praxis gewährleistet und das Risiko der Einschleppung von Rückständen körperfremder Substanzen effektiv reduziert. UCF.METM rTEV-Protease zeigt optimale Aktivität unter Bedingungen von pH 7,0 und 30 °C. Sie bleibt jedoch auch unter einem breiten Spektrum von Bedingungen mit pH 6,0–8,5 und Temperaturen von 4–30 °C aktiv, um den unterschiedlichen Anforderungen der Proteinverarbeitung gerecht zu werden. Es ist erwähnenswert, dass UCF.METM rTEV-Protease verfügt an ihrem N-Terminus über ein 6×His-Tag, das effizient mit Ni-NTA-Harz entfernt werden kann, wodurch eine präzise Reinigung des Zielproteins erreicht wird.
Leistungsanzeige
1. Hohe Spaltungseffizienz: Das Protein-Tag wird gründlicher abgespalten
Unter Verwendung des Fusionsproteins (3 μg), das das UCF.ME enthältTM rTEV-Protease-Spaltstelle als Substrat, UCF.METM rTEV-Protease wurde in Konzentrationen von 10, 5 und 3 U zugegeben und die Reaktion 1 h lang bei 30 °C durchgeführt. Der Spaltungseffekt wurde mittels Agarosegelelektrophorese nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigten, dass YerleichternUCF.ME vonTM rTEV-Protease konnte das Substrat effizient spalten, wenn die Eingangsmenge mehr als 3 U betrug, mit einer Spaltungseffizienz von >90 %.
Abbildung 3. Überprüfung der Spaltungsaktivität von UCF.METM rTEV-Protease
2. Geringe gDNA-Rückstände des Wirts: Reduziert effektiv das Risiko der Einführung von Rückständen exogener Substanzen
Durch Testen des Hosts (Escherichia coli) gDNA-Reste in verschiedenen Chargen von UCF.METM rTEV Protease, die Ergebnisse zeigten, dass der Wirt gDNA Rest von UCF.METM rTEV-Protease lag weit unter <1 Kopie/U.
Abbildung 4. Die Ergebnisse des Wirts-gDNA-Restes in UCF.METM rTEV-Protease
3. Vielfältige Anwendungsmöglichkeiten: Kann unterschiedliche Anforderungen an die Proteinverarbeitung erfüllen.
Durch die Überprüfung der Spaltungsaktivität von UCF.METM rTEV Protease unter verschiedenen Bedingungen, zeigten die Ergebnisse, dass UCF.METM Die rTEV-Protease zeigte unter Bedingungen von 4–30 °C eine starke Aktivität, wodurch die unterschiedlichen Anwendungsanforderungen der Kunden erfüllt werden konnten.
| Reaktionszeit (H) | Spaltungsaktivität bei unterschiedlichen Temperaturen (%) | |||
| 4℃ | 16℃ | 21℃ | 30℃ | |
| 1 | 34 | 58 | 56 | 85 |
| 2 | 58 | 80 | 78 | 90 |
| 3 | 71 | 99 | 99 | 99 |
| 3.5 | 84 | 99 | 99 | 99 |
Yerleichternvon empfohlene Fusion Tag Cutting Protein Produkte
| Produkt Name | Produkt NUmber | |
| TEV Protease | UCF.METM rTEV-Protease | 20427ES |
| Enterokinase | Enterokinase, rekombinant | 20395ES |
| SUMO-Protease | SUMO-Protease | 20410ES |
| 3C-Protease | 3C-Protease | 20409ES |
Verweise:
[1] Parikh I , Cuatrecasas P .Affinitätschromatographie[J].Vox Sanguinis, 1972, 23(1-2):141-146.DOI:10.1159/000466530.
[2] Paththamperuma C, Page R C. Fluoreszenz-Dequenching-Test zur Bestimmung der Aktivität der TEV-Protease[J]. Analytische Biochemie, 2022, 659: 114954.