Über T4 DNA Ligase
Allerdings ist T4 DNA Ligase in der Praxis noch mit einigen Herausforderungen konfrontiert, darunter mangelnde Stabilität, hohe Adapter-Adapter-Ligation oder geringe DNA-Bibliotheksausbeute. Diese Probleme können zu einer verringerten Versuchseffizienz, verminderter Datenqualität, schlechter Wiederholbarkeit der Versuchsergebnisse und geringer Produktreinheit führen, was sich wiederum auf die Gesamtwirksamkeit molekularbiologischer Experimente und die Genauigkeit der Sequenzierungsdaten auswirkt. Um diese Probleme zu lösen, hat Yeasen auf der Grundlage des innovativen ZymeEditor seiner Tochtergesellschaft Molefuture™ Eine Enzymevolutionsplattform hat eine Enzymevolution an der T4-DNA-Ligase durchgeführt.
Abb. 1 Schematische Darstellung des Reaktionsprinzips der T4 DNA Ligase[1]
Iteratives Nass- und Trocken-Experiment-Screening zur Erlangung einer hochleistungsfähigen T4-DNA-Ligase
T4 DNA Ligase, ein ATP-abhängiges Ligase-Enzym, besteht aus einer kompakt-helikalen DNA-Bindungsdomäne (DBD), einer Nukleotidyl-Transferase-Domäne (NTase) und einer OB-Faltungsdomäne. Basierend auf der Proteinstruktur, Yeasens Team analysierten die Reste, die Entfernungen von 5 bis 20 Å um das DNA-Substrat herum abdecken, gefolgt von einem In-silico-Screening und einer Struktur-Funktions-Analyse mit Hilfe moderner Computertools. Während dieses Prozesses beobachtete eine flexible Schleife, die weit entfernt von der aktiven Tasche lag. Anhand von Energieberechnungen konnte das Team entwarfen Verkürzungen in dieser Schleifenregion, wobei sie die Hypothese aufstellten, dass sie die Ligationsfunktion zwar nicht wesentlich beeinträchtigen, aber die allgemeine strukturelle Stabilität beeinträchtigen könnten. Darüber hinaus ausgerichtete Konsensussequenzen zur Entwicklung von Mutanten, wobei diese Analyse mit strukturell-funktionellen Überlegungen verknüpft wird, wie in der folgenden Abbildung dargestellt.
Abb. 2 Struktur der T4 DNA Ligase
Neben dem rationalen Design wurde die gezielte Evolution der T4-DNA-Ligase mit der MTPS-Methode durchgeführt, indem Stabilität, Aktivität und Restaktivität untersucht wurden. Und eine Bibliothek von über 104 Mutanten wurden gescreent. Nach einer gründlichen Analyse der Mutationsdaten wurden vielversprechende Kandidaten für die Reinigung und strenge Tests ausgewählt. Anschließend wurden alle Gewinner, die durch rationales Design und gerichtete Evolution gewonnen wurden, nach verfeinerter Reinigung einer detaillierten Charakterisierung unterzogen, die Bewertungen von Aktivität, Stabilität, Adapter-Selbstligation, DNA-Fragment-Selbstligation und DNA-Ausbeute umfasste. Basierend auf G1-Mutanten hat das Team DNA-Shuffling durchgeführt und gezieltes Mutationsdesign kombiniert, um außergewöhnliche Mutanten zu erhalten, die den vielfältigen Anwendungsanforderungen gerecht werden.
Von der Mutante zum Marktprodukt mit mehreren Runden der Sequenzvalidierung
Der ZymeEditorTM Mithilfe einer Enzymevolutionsplattform wurde erfolgreich ein T4-DNA-Ligase-Mutant mit hoher thermischer Stabilität, hoher Bibliotheksausbeute und geringer Adapter-Selbstligation durch Enzymevolutionstechnologie entwickelt. Die aktuell verbesserte T4 DNA Ligase wurde erfolgreich auf den Markt gebracht: Hieff® Versatile T4 DNA Ligase (600 U/μL) (Kat.-Nr. 12996ES). Dieses Produkt übertrifft die herkömmliche Wildtyp-T4-DNA-Ligase hinsichtlich Ligationseffizienz und thermischer Stabilität und wurde durch Hochdurchsatzsequenzierung verifiziert, was eine hervorragende Qualität gewährleistet.
Datenpräsentation
1.Höhere thermische Stabilität
Die T4 DNA Ligase Mutanten von Yeasen wurden einer Wärmebehandlung bei 42℃ unterzogen für 0, 2 und 4 Stunden und wurden mit T4-DNA-Ligasen der Anbieter Q, N, A und T verglichen.Anschließend wurde mit dem Yeasen DNA Library Construction Kit (Kat.-Nr. 12927ES) eine DNA-Bibliothek des gesamten Genoms unter Verwendung von 1 µg fragmentierter boviner gDNA erstellt, um die thermische Stabilität der T4-DNA-Ligase zu vergleichen.
Abb. 3: Thermischer Stabilitätstest bei 42 °C
Ergebnisse:
Thermische Stabilität: Yeasen ≈ Anbieter N ≈ Anbieter A > Anbieter T > Anbieter Q.
2. Höhere Bibliotheksausbeute
Der T4 DNA Ligase-Mutant von Yeasen wurde auf Bibliotheksausbeute bei hohen und niedrigen DNA-Eingangsmengen getestet und mit T4 DNA Ligasen der Anbieter Q, N, A und T verglichen. Es wurde das Yeasen DNA Library Construction Kit (Kat.-Nr. 12927ES) verwendet, wobei 1 µg und 0,5 ng fragmentierte bovine gDNA zur Konstruktion der DNA-Bibliotheken eingegeben wurden.
Abb. 4: Analyse der DNA-Bibliotheksausbeute
Ergebnisse:
Bibliotheksausbeute (1 µg gDNA): Yeasen > Anbieter Q ≈ Anbieter T ≈ Anbieter A > Anbieter N.Bibliotheksausbeute (0,5 µg gDNA): Yeasen ≈ Anbieter Q ≈ Anbieter A ≈ Anbieter T > Anbieter N.
3. Selbstligation des unteren Adapters
Der T4 DNA Ligase-Mutant von Yeasen wurde mit T4 DNA Ligasen der Anbieter Q, N, A und T auf Adapter-Selbstligation verglichen. Das Yeasen DNA Library Construction Kit (Kat.-Nr. 12927ES) wurde verwendet, wobei 0 ng und 0,5 ng fragmentierte bovine gDNA als Input verwendet wurden, um DNA-Bibliotheken des gesamten Genoms zu konstruieren.
Abb. 5 Adapter-Selbstligationsdaten mit 0 ng (links) und 0,5 ng (rechts) gDNA-Eingabe
Ergebnisse:
1) Adapter-Selbstligationsrate (0 ng gDNA): Anbieter N > Yeasen > Anbieter T > Anbieter A > Anbieter Q.
2) Adapter-Selbstligationsrate (0,5 ng gDNA): Yeasen > Anbieter T > Anbieter Q ≈ Anbieter N > Anbieter A.
Kontaktieren Sie uns
Yeasen hat die Einschränkungen herkömmlicher T4-DNA-Ligasen erfolgreich überwunden und bietet ein T4-DNA-Ligase-Produkt an, das sich durch hervorragende thermische Stabilität, Bibliotheksausbeute und Adapter-Selbstligation auszeichnet. Dabei hat das Unternehmen eine umfangreiche Bibliothek von Mutanten aufgebaut, die Forschern eine Vielzahl von Optionen bietet, um unterschiedliche experimentelle Anforderungen zu erfüllen. Wenn Sie an unseren Produkten oder T4-DNA-Ligase-Mutanten interessiert sind, können Sie uns gerne über die folgenden Methoden kontaktieren. E-Mail: order1@yeasen.com (UNS)
Telefon: +1 240-472-6069 (US)
Darüber hinaus bietet Yeasen eine Reihe von T4 DNA-Ligase-Produktserien an. Klicken Sie auf den Produktlink, um Produktinformationen anzufordern
Yeasen T4 DNA Ligase Produktserie
| Produktpositionierung | Produktname | Kat.-Nr. |
| Hohe thermische Stabilität und niedrige Selbstligationsrate | Hieff® Vielseitige T4 DNA Ligase (600 U/μL) | 12996ES |
| Schnelle und effiziente Ligation, geringer Rückstand, perfekt geeignet für die Anforderungen der Krankheitserregererkennung. | Schnelle T4 DNA Ligase (400 U/µL) | 10299ES |
| Universalmodell | Schnelle T4 DNA Ligase (400 U/µL) | 10301ES |
Verweise
[1] Shuman S.DNA Ligasen: Fortschritte und Perspektiven[J].Journal of Biological Chemistry, 2009, 284(26):17365-17369.
