RNase HII, auch bekannt als RNase H2, ist eine Endoribonuklease, die speziell die Phosphodiesterbindung am 5'-Ende eines einzelnen Ribonukleotids, das in einer doppelsträngigen DNA-Helix eingebettet ist, angreift und trennt, wodurch eine 5'-Phosphat- und eine 3'-Hydroxylgruppe entstehen (Abb. 1). Dieses Enzym weist eine minimale Spaltungsaktivität gegenüber einzelsträngiger RNA auf und ist sowohl gegenüber doppelsträngiger DNA (dsDNA) als auch einzelsträngiger DNA (ssDNA) inaktiv. RNase HII ist im Temperaturbereich von 50 °C bis 75 °C funktionell aktiv und erreicht ihre Spitzenleistung bei Temperaturen zwischen 70 °C und 75 °C. RNase HII nutzt seine einzigartige Fähigkeit, gezielte, einzelsträngige Spaltungen an DNA-Stellen durchzuführen, an denen ein Ribonukleotid integriert ist, ohne dsDNA oder ssDNA zu beeinträchtigen, und dient als präziser „Auslöser“ für die Reaktionsinitiierung, einschließlich Primeraktivierung und -verlängerung, um eine spezifische Amplifikation zu erreichen. Dieses Enzym spielt eine zentrale Rolle bei der RNase H-abhängigen PCR (rhPCR), der Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)-Technologie und dem Abbau von RNA-Komponenten in Okazaki-Fragmenten.
Abb. 1. Schematische Darstellung des RNase HII-Reaktionsprinzips
Die funktionellen Anwendungen von RNase HII
RNase H-abhängige PCR(rhPCR)
Die rhPCR integriert RNase HII und speziell entwickelte, geschlossen spaltbare rhPCR-Primer in den PCR-Prozess. Dieser Ansatz nutzt die einzigartige Eigenschaft von RNase HII, RNA in DNA-RNA-Hybriden selektiv zu hydrolysieren, während die Phosphodiesterbindungen in einzelsträngiger oder doppelsträngiger DNA und RNA intakt bleiben. Infolgedessen verdaut RNase HII das DNA-RNA-Hybrid nur dann und ermöglicht eine Primerverlängerung, wenn der Primer perfekt komplementär zur Ziel-DNA-Sequenz ist. Diese gezielte Aktion verbessert die Genauigkeit der Reaktion erheblich. RNase HII ist das einzige Enzym, das die präzise Entfernung von Ribonukleotiden einleiten kann, ohne Mutationen durch Spaltung am 5'-Ende der Ribonukleinsäure zu induzieren. Aufgrund seiner hohen Spezifität, Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit bietet rhPCR deutliche Vorteile bei Anwendungen wie der Erkennung von Einzelnukleotidpolymorphismus (SNP), der Gentypisierung, der gleichzeitigen Erkennung mehrerer Ziele und der Umweltnukleinsäureanalyse.
Technische Route
1. Grundierungsdesign
Das Primerdesign muss sicherstellen, dass die Schmelztemperatur nach dem Schneiden höher ist als die Annealing-Temperatur, um sicherzustellen, dass der Primer während der PCR-Zyklen stabil an die Vorlage bindet. Der rhPCR-Primer besteht aus drei Teilen:
1) 5'-DNA-Segment: In Länge und Schmelztemperatur (Tm) mit Standard-PCR-Primern vergleichbar, kann es sich nach dem Schneiden durch das Enzym RNase HII effektiv mit der Matrizen-DNA paaren und von dieser aus verlängern.
2) Eine einzelne RNA-Base: bietet eine Schnittstelle für RNase HII.
3) 3'-DNA-Segment: Eine Länge von vier oder fünf Basen mit einem Blocker, normalerweise einem kurzen, nicht verlängerbaren Molekül wie Propylenglykol, das die Verlängerung der DNA-Polymerase verhindert, bis der Blocker entfernt wird.
2.Schneiden und Verlängern
Zu Beginn der rhPCR-Reaktion sind Primer und Template-DNA frei. Wenn der Primer an das spezifische RNA:DNA-Heteroduplex-Template bindet, wird die RNA-Base 5'-Seite des blockierten Primers erkannt und vom RNase HII-Enzym geschnitten, wodurch ein DNA-Oligonukleotid mit einer 3'-Hydroxylgruppe zurückbleibt, das einen Ausgangspunkt für die Verlängerung durch die DNA-Polymerase darstellt. Darauf folgt der herkömmliche PCR-Amplifikationsprozess.
Abb. 2. Diagramm des rhPCR-Prinzips [1]
二.Schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (LAMP)
Die Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) ist eine einfache und schnelle Methode zur Genamplifikation, mit der Nukleinsäuren unter isothermen Bedingungen in kurzer Zeit amplifiziert werden können. Aufgrund der Einleitung der DNA-Polymeraseaktivität während der Präparation bei Raumtemperatur bilden sich jedoch unspezifische Fehlpaarungen, die zu einer geringen Anzahl von Fehlpaarungen und Primerdimeren führen können, was wiederum zu geringfügigen Verunreinigungen führt, die zu falsch positiven Ergebnissen führen können.
Durch die Anwendung von RNase HII auf das LAMP-Amplifikationssystem kann das Problem falsch-positiver Ergebnisse in der LAMP-Technologie effektiv gelöst und ihre Anwendung in der klinischen Diagnostik erweitert werden. Wie in Abb. 3 gezeigt, spaltet das RNase HII-Enzym bei der primeraktivierten LAMP-Methode (PA-LAMP) unter Verwendung von RNase HII spezifisch die RNA am Primer, wenn sich der Primer mit der Ziel-ssDNA paart, wodurch dieser aktiviert wird und eine Primerverlängerung ermöglicht wird. Dadurch wird eine spezifische Amplifikation erreicht und falsch-positive Ergebnisse im System effektiv reduziert.
Abb. 3. Schematische Darstellung des PA-LAMP-Prinzips [2]
YEASEN RNase HII
RNase HII von YEASEN (Kat.-Nr. 14539) ist abgeleitet von Pyrococcus abyssi, Pa, und es ist frei von kontaminierenden Nukleasen, Nicking-Enzymen und RNase-Rückständen, mit geringer Wirts-DNA-Kontamination, was falsch-positive Ergebnisse im System effektiv reduziert. YEASENs RNase HII ist extrem hitzebeständig und behält seine Aktivität sogar nach 30 Minuten bei 95 °C bei, wodurch es mit verschiedenen rhPCR-Reaktionssystemen kompatibel und auch für LAMP und andere Anwendungen geeignet ist.
1. E. coli genomische DNA-Reste < 0,5 Kopien/100 U
Erkennung von Escherichia coli Die Untersuchung genomischer DNA-Rückstände in verschiedenen Chargen von RNase HII zeigte, dass der genomische DNA-Rückstand des Wirts von YEASENs RNase HII weit unter 0,5 Kopien/100 U liegt.
Abb. 4. Erkennung von Escherichia coli genomische DNA-Reste
2. 95°C Hitzebeständigkeitstest
Nach dem Erhitzen von RNase HII auf 95 °C für 0 bis 45 Minuten wurde die Enzymaktivität von RNase HII getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass selbst nach 45 Minuten Erhitzen bei YEASENs RNase HII fast kein Verlust der Enzymaktivität auftrat.
Abb. 5. 95°C Hitzebeständigkeitstest
3. Keine Exonuklease, Nicking-Enzym oder RNase-Rückstände (1 U-Dosis)
Nach 4-stündiger Inkubation von 1 U verschiedener Chargen von RNase HII mit ihren jeweiligen Substraten DNA/RNA bei 37 °C ergab die Agarosegelelektrophorese, dass in RNase HII keine Exonuklease, kein Nicking-Enzym und kein RNase-Rückstand vorhanden war.
Abb. 6.Nachweisergebnisse von Exonuklease-, Nicking-Enzym- und RNase-Resten
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| Produktanwendung | Produktname | Katalognummer |
| rhPCR, LAMPE | 14539ES 14541ES | |
| rhPCR | 10101ES | |
| RT-LAMP | 14402ES | |
| 11111ES |
Verweise
[1] Dobosy JR, Rose SD, Beltz KR, Rupp SM, Powers KM, Behlke MA, Walder JA. RNase H-abhängige PCR (rhPCR): verbesserte Spezifität und Einzelnukleotid-Polymorphismus-Erkennung durch blockierte spaltbare Primer. BMC Biotechnol. 2011 Aug 10;11:80. doi: 10.1186/1472-6750-11-80.
[2] Du WF, Ge JH, Li JJ, et al. Einzelschritt, hochspezifische Erkennung einer Einzelnukleotidmutation durch primeraktivierbare, schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (PA-LAMP)[J].Analytica chimica acta, 2019(1050-):1050.DOI:10.1016/j.aca.2018.10.068.