Abbildung 1. Schematische Darstellung der Spaltung von dsDNA durch DNase I in Gegenwart von Mg²⁺ und Mn²⁺

Gewöhnliche DNase I wird hauptsächlich aus Rinderpankreas isoliert oder ist ein rekombinantes Enzym. Im Vergleich zu aus Rinderpankreas isolierter DNase I weist rekombinante DNase I relativ geringere endogene RNase-Werte auf oder kann als RNase-freies Produkt formuliert werden, wodurch sie sich besser für RNase-empfindliche Anwendungen eignet, wie etwa die Entfernung von DNA aus RNA-Proben.

Anwendungen

Was die Anwendungen betrifft, ist DNase I für ihre Verwendung in Experimenten zur Aufrechterhaltung der RNA-Integrität bekannt, wie etwa bei der Extraktion von DNA-freier RNA, der Herstellung von RNA-Vorlagen ohne gDNA vor der Reverse-Transkription und dem Abbau von DNA-Vorlagen nach der In-vitro-Transkription. Darüber hinaus kann sie zum Verdauen von DNA-Sonden bei der rRNA-Entfernung, zur DNA-Markierung durch Nick-Translation, zur Analyse von DNA-Protein-Interaktionen mithilfe der Footprinting-Methode, zur Erzeugung zufälliger DNA-Bibliotheken, zur Verringerung der Viskosität von Zelllysaten oder Proteinextrakten, zum Verdauen von Zelladhäsionen als Zusatz in Zellkulturen und zum teilweisen Spalten genomischer DNA als positive Kontrolle in TUNEL-Tests zur Apoptoseerkennung verwendet werden. Zusammenfassend kann DNase I in fast allen Anwendungen verwendet werden, die einen enzymatischen Verdau von DNA erfordern. Im Folgenden wird eine kurze Einführung in einige gängige Anwendungen gegeben.

• Entfernung von gDNA vor RNA-Extraktion oder Reverse-Transkription

RNA, eine in Laboren häufig untersuchte Probe, beeinflusst aufgrund ihrer eigenen Qualität die Qualität experimenteller Daten stark. Es ist im Allgemeinen unmöglich, gDNA-Rückstände während des RNA-Extraktionsprozesses vollständig zu vermeiden. Daher wird normalerweise empfohlen, RNA-Proben vor der Durchführung anspruchsvoller nachgelagerter Anwendungen (wie mRNA-Expressionsanalyse, Transkriptomanalyse usw.) mit DNase I zu behandeln, um restliche gDNA zu verdauen. Der Verdauungsprozess von gDNA kann während der RNA-Extraktion, nach der RNA-Extraktion oder vor der RNA-Reverse-Transkription durchgeführt werden.

Abbildung 2. DNase I-basierter gDNA-Entfernungsprozess

• Entfernung von Matrizen-DNA bei der In-vitro-Transkription

Bei der In-vitro-Transkription (IVT) wird hauptsächlich DNA als Vorlage verwendet, um unter dem Einfluss geeigneter Substrate und Puffer RNA zu produzieren. Zu den in diesem Prozess häufig verwendeten RNA-Polymerasen gehören T7, T3 und SP6, die für die Katalyse der RNA-Synthese verantwortlich sind. Das synthetisierte RNA-Produkt kann jedoch DNA-Reste enthalten, und die Beseitigung dieser Reste ist für nachfolgende Experimente von Vorteil.

Insbesondere im Entwicklungsprozess von mRNA-Impfstoffen ist das Entfernen dieser DNA-Rückstände ein kritischer Schritt, der sich direkt auf die Schwierigkeit nachfolgender Reinigungsprozesse und die Reinheit des Endprodukts auswirkt.Um die Vorlagen-DNA effizient zu eliminieren, wird zur Behandlung typischerweise DNase I verwendet, um sicherzustellen, dass die RNA-Probe frei von DNA-Rückständen ist, ein Schritt, der dazu beiträgt, die allgemeine Genauigkeit und Effizienz des Experiments zu verbessern.

Abbildung 3: In-vitro-Transkriptionsprozess mit linearisiertem Plasmid als Vorlage^[4]

• rRNA-Entfernung beim Aufbau und der Sequenzierung von RNA-Bibliotheken

In Organismen ist rRNA in großer Menge vorhanden und stark konserviert, was für die Erforschung biologischer Informationen von geringer Bedeutung ist. Allerdings sind 95 % der gesamten während der Experimente extrahierten RNA menschliche rRNA, und das Vorhandensein dieser rRNAs kann die Erkennung von Ziel-RNAs beeinträchtigen. Daher wird bei der Vorbereitung und Sequenzierung von RNA-Bibliotheken normalerweise zuerst rRNA entfernt. Derzeit ist die Hauptmethode zur Entfernung von rRNA die RNAase-Verdauung, und ihre wichtigste operative Methode ist die Entfernung von rRNA. Schritte und Prinzipien sind wie folgt:

1. Gesamt-RNA extrahieren;
2. Hybridisieren Sie einzelsträngige DNA-Sonden mit rRNA-Molekülen (Hinweis: Entwerfen und synthetisieren Sie rRNA-spezifische einzelsträngige DNA-Sonden).
3. RNase H baut die hybridisierte rRNA ab;
4. DNase I baut die DNA-Sonden ab;
5. rRNA wird erfolgreich entfernt, zurück bleiben nicht-rRNA-RNA-Vorlagen.

Abbildung 4: Schematische Darstellung des Prinzips der rRNA-Entfernung auf Basis einer enzymatischen Methode^[5]

• Nick-Übersetzung zur DNA-Markierung

Die Nick-Translation ist die am häufigsten verwendete Methode zur Markierung von Desoxyribonukleinsäuresonden im Labor. Diese Methode wird durch die kombinierte Wirkung von DNase I und E.coli DNA-Polymerase I.

Das Grundprinzip lautet wie folgt:

1. Verwenden Sie zunächst eine geeignete Konzentration von DNase I, um in jedem Strang der zu markierenden doppelsträngigen DNA mehrere Einzelstrang-Einschnitte zu erzeugen, wodurch an den Einschnittstellen 3'-Hydroxylendigen entstehen.
2. Dann verwenden Sie die 5'→3' Exonuklease-Aktivität von coliDNA-Polymerase I, um ein Nukleotid vom 5'-Ende des Nicks zu entfernen, während die 5'→3'-Polymeraseaktivität von E. coli DNA-Polymerase I fügt ein markiertes Nukleotid am 3'-Ende des Einschnitts ein, um ihn zu reparieren. Während sich der Einschnitt entlang des DNA-Strangs bewegt, werden die markierten Nukleotide in den neu synthetisierten DNA-Strang eingebaut.

Abbildung 5: Schematische Darstellung des Prinzips der DNA-Markierung durch Nick-Translation^[6]

• DNase I-Footprinting-Assay-Experiment

Der DNase I-Footprinting-Test ist eine präzise Methode zur Identifizierung der Bindungsstellen von DNA-bindenden Proteinen an DNA-Molekülen. Das Prinzip besteht darin, dass an ein DNA-Fragment gebundene Proteine ​​die gebundene Region vor dem Abbau durch DNase I schützen. Nach der enzymatischen Verdauung kann das verbleibende Fragment (der „Footprint“) zur Bestimmung seiner Sequenz verwendet werden. Im Gelbild sind keine Bänder zu sehen, die den Regionen entsprechen, an denen das Protein gebunden ist.

Das Grundprinzip lautet wie folgt:

1. Markieren Sie die einzelsträngigen Enden des zu testenden doppelsträngigen DNA-Moleküls.
2. Mischen Sie das Protein mit DNA und fügen Sie eine entsprechende Menge DNase I zur enzymatischen Verdauung hinzu, wodurch DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge entstehen.Die Enzymmenge sollte kontrolliert werden, um sicherzustellen, dass sich benachbarte DNA-Fragmente nur in einem Nukleotid unterscheiden, und eine Kontrolle ohne zugesetztes Protein sollte parallel mitgeführt werden.
3. Entfernen Sie das Protein aus der DNA, trennen Sie die denaturierte DNA durch PAGE-Elektrophorese und führen Sie eine Autoradiographie durch, um die Nukleotidsequenz der Footprint-Region durch Vergleich mit der Kontrollgruppe zu interpretieren.

Abbildung 6: Prinzipskizze des DNase I-Footprinting-Tests^[7]

Der DNase I Auswahlhilfe für Yeasen

Um den unterschiedlichen Anwendungsanforderungen gerecht zu werden, bietet Yeasen rekombinant DNase I In Escherichia coliund kann DNase I in GMP-Qualität bereitstellen, um die Anforderungen der mRNA-In-vitro-Transkription und anderer Anwendungen zu erfüllen.

Produktpositionierung	Anwendung	Produktname	Katalognummer
RNase-frei	Entfernen von DNA aus RNA- und Proteinpräparaten	Rekombinante DNase I (RNase-frei)	10325ES
GMP-Qualität, RNase-frei	In-vitro-Transkription von mRNA	UCF.ME® Desoxyribonuklease I (DNase I) GMP-Qualität	10611ES

Verweise

[1] Ndiaye C, Mena M, Alemany L, et al. HPV-DNA-, E6/E7-mRNA- und p16INK4a-Erkennung bei Kopf- und Halskrebs: eine systematische Überprüfung und Metaanalyse[J]. The Lancet Oncology, 2014, 15(12): 1319-1331.

[2] Broccolo F, Fusetti L, Rosini S, et al. Vergleich der onkogenen HPV‐typspezifischen viralen DNA‐Last und des E6/E7‐mRNA‐Nachweises in Gebärmutterhalsproben: Ergebnisse einer multizentrischen Studie[J]. Journal of medical virology, 2013, 85(3): 472‐482.

[3] Huang Z, Fasco MJ, Kaminsky L S. Optimierung der Dnase I-Entfernung kontaminierender DNA aus RNA für den Einsatz in der quantitativen RNA-PCR[J]. Biotechniques, 1996, 20(6): 1012-1020.

[4] Kang DD, Li H, Dong Y. Fortschritte bei in vitro transkribierter mRNA (IVT-mRNA), um die Translation in die Klinik zu ermöglichen[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2023, 199: 114961.

[5] Wiame I, Remy S, Swennen R, et al. Irreversible Hitzeinaktivierung von DNase I ohne RNA-Abbau[J]. Biotechniques, 2000, 29(2): 252-256.

[6] Adolph S, Hameister H. In-situ-Nick-Translation von Metaphasenchromosomen mit Biotin-markiertem d-UTP[J]. Human Genetics, 1985, 69: 117-121.

[7] Song C, Zhang S, Huang H. Auswahl einer geeigneten Methode zur Identifizierung von Replikationsursprüngen in mikrobiellen Genomen. Front Microbiol, 2015, 6: 1049.