Der Ct-Wert ist eine entscheidende Ergebnisdarstellung bei der fluoreszierenden quantitativen PCR. Er wird verwendet, um Unterschiede in den Genexpressionsniveaus oder Genkopienzahlen zu berechnen. Welcher Ct-Wertbereich kann also bei der fluoreszierenden Quantifizierung als angemessen angesehen werden? Wie können wir sicherstellen, dass die Ct-Werte innerhalb eines effektiven Bereichs liegen? Lassen wir heute Xiao Yi diese Frage für alle beantworten.
Was ist der Ct-Wert?
Im qPCR-Amplifikationsprozess bezieht sich der Ct-Wert auf die Anzahl der Amplifikationszyklen (Zyklusschwelle), bei denen das Fluoreszenzsignal des amplifizierten Produkts die eingestellte Fluoreszenzschwelle erreicht. „C“ steht für Zyklus und „T“ für Schwelle. Einfach ausgedrückt ist der Ct-Wert die Anzahl der Zyklen, die die Ausgangsvorlage in qPCR benötigt, um eine bestimmte Produktmenge zu erreichen, was später noch näher erläutert wird.
Welche Funktion hat der Ct-Wert?
1. Zusammenhang zwischen exponentieller Amplifikation, Template-Menge und Ct-Wert
Im Idealfall werden Gene während der qPCR exponentiell amplifiziert und akkumulieren sich über eine bestimmte Anzahl von Zyklen. Die Beziehung zwischen der Anzahl der Amplifikationszyklen und der Produktmenge kann wie folgt ausgedrückt werden: Menge des amplifizierten Produkts = anfängliche Vorlagenmenge × (1 + En)^Anzahl der Zyklen. Allerdings finden qPCR-Reaktionen nicht immer unter idealen Bedingungen statt. Wenn die Menge des amplifizierten Produkts eine „bestimmte Produktmenge“ erreicht, ist die Anzahl der Zyklen an diesem Punkt der Ct-Wert, der den Zeitraum der exponentiellen Amplifikation angibt. Die Beziehung zwischen dem Ct-Wert und der anfänglichen Vorlagenmenge ist wie folgt: Es besteht eine lineare Beziehung zwischen dem Ct-Wert einer Vorlage und dem Logarithmus der anfänglichen Kopienzahl dieser Vorlage. Eine höhere Konzentration der anfänglichen Vorlage führt zu einem niedrigeren Ct-Wert, während eine niedrigere Konzentration der anfänglichen Vorlage zu einem höheren Ct-Wert führt.
2. Amplifikationskurve, Fluoreszenzschwelle und eine bestimmte Produktmenge
Die Menge der qPCR-Amplifikationsprodukte wird direkt in Form von Fluoreszenzsignalen dargestellt, die als Amplifikationskurve bezeichnet werden. In den frühen Phasen der PCR, wenn die Amplifikation unter idealen Bedingungen erfolgt und die Anzahl der Zyklen gering ist, ist die Ansammlung von Produkten minimal und das erzeugte Fluoreszenzniveau ist nicht deutlich vom Hintergrundfluoreszenzrauschen zu unterscheiden. Anschließend tritt die Fluoreszenzproduktion in die exponentielle Phase ein. Die Menge des PCR-Produkts kann an einem bestimmten Punkt nachgewiesen werden, wenn die Reaktion gerade in die exponentielle Phase eintritt, was als „bestimmte Produktmenge“ bezeichnet wird. Daraus kann auf den anfänglichen Inhalt der Vorlage geschlossen werden. Daher wird die Fluoreszenzsignalintensität, die der bestimmten Produktmenge entspricht, als Fluoreszenzschwelle bezeichnet.
In den späteren Stadien der PCR weist die Amplifikationskurve keine exponentielle Amplifikation mehr auf und tritt in die lineare Phase und die Plateauphase ein.
3. Die Reproduzierbarkeit von Ct-Werten
Wenn die PCR-Zyklen die Anzahl von Zyklen erreichen, bei denen der Ct-Wert auftritt, beginnt gerade die echte exponentielle Amplifikationsphase. Zu diesem Zeitpunkt wurden kleinere Fehler noch nicht amplifiziert, sodass die Reproduzierbarkeit der Ct-Werte ausgezeichnet ist. Dies bedeutet, dass die erhaltenen Ct-Werte konstant bleiben, unabhängig davon, ob dieselbe Vorlage zu unterschiedlichen Zeiten oder gleichzeitig in unterschiedlichen Röhrchen amplifiziert wird.
In welchem Bereich liegen die Ct-Werte?
1.Verstärkungseffizienz En
Unter PCR-Amplifikationseffizienz versteht man die Effizienz, mit der die Polymerase das Zielgen in Amplifikationsprodukte umwandelt.Die Amplifikationseffizienz beträgt 100 %, wenn ein DNA-Molekül in zwei DNA-Moleküle umgewandelt wird. Die Amplifikationseffizienz wird üblicherweise als En bezeichnet. Um die Analyse in nachfolgenden Artikeln zu erleichtern, folgt hier eine kurze Einführung in die Faktoren, die die Amplifikationseffizienz beeinflussen.
| Einflussfaktoren | Erläuterung | Urteile |
| A. PCR-Inhibitoren | 1. Die Matrizen-RNA kann Substanzen enthalten, die die PCR-Reaktion hemmen, wie beispielsweise Proteine oder Detergenzien. 2. Die nach der Reversen Transkription erhaltene cDNA kann hohe Konzentrationen an Matrizen-RNA und Komponenten der Reversen Transkriptionsreagenzien enthalten, die ebenfalls eine nachfolgende PCR hemmen könnten. | 1. Das Vorhandensein einer Kontamination kann durch Messen der Verhältnisse A260/A280 und A260/A230 oder durch Durchführen einer RNA-Elektrophorese festgestellt werden. 2. Ob die cDNA nach der Reversen Transkription in einem bestimmten Verhältnis verdünnt wird. |
| B. Unangemessenes Primer-Design | Primer kann nicht effektiv aushärten. | Überprüfen Sie, ob in den Primern Dimere oder Haarnadelstrukturen vorhanden sind und ob Fehlpaarungen vorliegen. Manchmal ist es notwendig, auf das Design der überspannenden Introns zu achten. |
| C. Ungeeignetes Reaktionsverfahren | 1. Die Primer können nicht effektiv aushärten. 2. Die Aktivität der DNA-Polymerase wird nicht vollständig freigesetzt. 3. Durch über längere Zeit hohe Temperaturen nimmt die Aktivität der DNA-Polymerase ab. | 1. Die Annealingtemperatur ist höher als der Tm-Wert des Primers. 2. Die Vordenaturierungszeit ist zu kurz. 3. Die Dauer der einzelnen Schritte im Reaktionsprotokoll ist zu lang. |
| D. Reagenzien nicht gründlich gemischt oder Pipettierfehler | Im Reaktionssystem ist die lokale Konzentration der PCR-Reaktionskomponenten zu hoch oder ungleichmäßig, was zu einer nicht exponentiellen Amplifikation der PCR führt. | / |
| E.Amplikonlänge | Die Amplikonlänge ist zu groß und überschreitet 300 Basenpaare, was zu einer geringen Amplifikatioseffizienz führt. | Überprüfen Sie, ob die Amplikonlänge zwischen 80 und 300 Basenpaaren liegt. |
| F. Der Einfluss von qPCR-Reagenzien | Eine niedrigere Konzentration an DNA-Polymerase in den Reagenzien oder suboptimale Ionenkonzentrationen im Puffer führen dazu, dass das Taq-Enzym nicht seine maximale Aktivität erreicht. | Die Standardkurve wird verwendet, um die Amplifikationseffizienz der Primer zu messen. |
2. Der Bereich der Ct-Werte
Der Bereich der Ct-Werte liegt zwischen 15 und 35. Ein Ct-Wert unter 15 gilt als innerhalb der Basisphase liegend und hat den Fluoreszenzschwellenwert nicht erreicht. Im Idealfall besteht eine lineare Beziehung zwischen dem Ct-Wert und dem Logarithmus der anfänglichen Kopienzahl der Vorlage, die als Standardkurve bezeichnet wird. Unter Verwendung der Standardkurve wird bei einer Amplifikationseffizienz von 100 % der Ct-Wert zur Quantifizierung einer einzelnen Kopie des Gens auf etwa 35 berechnet. Wenn der Ct-Wert größer als 35 ist, ist die anfängliche Kopienzahl der Vorlage theoretisch kleiner als 1, was als statistisch unbedeutend angesehen werden kann.
Für verschiedene Gene erfordert der Ct-Wertbereich aufgrund von Variationen in der anfänglichen Vorlagenmenge an Genkopien und der Amplifikationseffizienz die Erstellung einer Standardkurve für dieses Gen, um den linearen Nachweisbereich des Gens zu berechnen.
3.Faktoren, die die Ct-Werte beeinflussen
Wie aus der Beziehung zwischen der Anzahl der Amplifikationszyklen und der Produktmenge hervorgeht: Amplifikationsproduktmenge = anfängliche Vorlagenmenge × (1 + En)^Anzahl der Zyklen, ist ersichtlich, dass unter idealen Bedingungen die anfängliche Vorlagenmenge und En den Ct-Wert beeinflussen. Unterschiede in der Vorlagenqualität oder der Amplifikationseffizienz können dazu führen, dass der Ct-Wert zu hoch oder zu niedrig ist.
4. Zu hohe oder zu niedrige Ct-Werte
Xiao Yi hat die Experten der technischen Abteilung unseres Unternehmens konsultiert und die Ursachen und Lösungen für die beiden häufigsten Arten von Problemen mit Ct-Werten zusammengefasst, um unsere Leser aufzuklären.
| Problem | Ursachen | Lösungen |
| Ct-Wert zu hoch | Die Template-Konzentration ist niedrig oder es sind PCR-Inhibitoren vorhanden. Die Verstärkungseffizienz ist gering. | 1. Erhöhen Sie die Vorlagenkonzentration. Erhöhen Sie das Verdünnungsverhältnis von RNA oder cDNA. Oder bereiten Sie die Vorlage erneut vor. 2. Verringern Sie die Annealing-Temperatur oder verwenden Sie eine zweistufige Amplifikationsmethode. Stellen Sie sicher, dass die Komponenten und das System gründlich gemischt sind. Optimieren Sie das Reaktionsprotokoll oder versuchen Sie, die Reagenzien auszutauschen. |
| Ct-Wert zu niedrig | 1. Hohe Template-Konzentration 2. Kontamination in NTC (No Template Control) und NRC (No Reverse Control) 3. Ungeeignetes Primer-Design | 1. Reduzieren Sie die Menge der Matrizen-RNA oder verdünnen Sie die cDNA in einem höheren Verhältnis. 2. Ersetzen Sie alle Reagenzien erneut oder verwenden Sie UDGase-Antikontaminationsreagenzien. 3. Optimieren Sie das Verfahren, um eine unspezifische Amplifikation zu vermeiden. |
Damit ist die Analyse der Ursachen für den abnormalen Ct-Wert abgeschlossen. Als Nächstes empfiehlt Xiao Yi eine Reihe kostengünstiger Produkte, um sicherzustellen, dass Ihre Versuchsdaten genauer und zuverlässiger sind. Kommen Sie und wählen Sie Ihre Favoriten aus!
| Produktname | Katze# | Größe |
| Hieff UNICON™ Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix | 11184ES08 | 5×1 ml |
| Hifair™ Ⅲ 1. Strang cDNA Synthese SuperMix für qPCR (gDNA Digester plus) | 11141ES60 | 100 T |
| Hifair™ AdvanceFast Ein-Schritt RT-gDNA Verdauung SuperMix für qPCR | 11151ES60 | 100 T |
| Hifair™ AdvanceFast 1. Strang cDNA Synthese Kit (ohne Farbstoff) | 11150ES60 | 100 T |