Fluoreszenz-quantitative PCR (qPCR) ist eine in Laboren häufig verwendete Technik, die zur Genexpressionsanalyse, Genotypisierung, Pathogenerkennung, SNP-Analyse und vielem mehr eingesetzt werden kann. Die Funktionsweise von qPCR ist einfach und das Prinzip leicht zu verstehen. Angesichts eines Haufens unübersichtlicher Daten wird die Analyse der Ergebnisse jedoch zu einer gewaltigen Aufgabe. Heute zeigt Ihnen Xiao Yi, wie Sie komplexe Prozesse vereinfachen und problemlos Daten erhalten, die in SCI-Zeitschriften veröffentlicht werden können!
Zu den bei qPCR verwendeten Analysemethoden gehören die relative und die absolute Quantifizierung. Die Wahl zwischen diesen Methoden sollte auf unterschiedlichen experimentellen Designs basieren. In dieser Ausgabe konzentrieren wir uns auf eine gängige Anwendung von qPCR – die Genexpressionsanalyse, bei der im Allgemeinen die Methode der relativen Quantifizierung ausgewählt wird.
Experimentelles Design
Angenommen, wir müssen derzeit die Wirkung der Lichtinduktion auf die Expression des Gens AtSUC2 von Arabidopsis untersuchen. Die Kontrollgruppe würde aus Arabidopsis-Pflanzen bestehen, die keiner Behandlung unterzogen wurden, während die Versuchsgruppe aus Pflanzen bestehen würde, die mit einer bestimmten Lichtinduktion behandelt wurden. Aus beiden Gruppen würde RNA extrahiert und rücktranskribiert, um cDNA zu erhalten, die dann als Vorlage verwendet würde. Das GAPDH-Gen von Arabidopsis würde als interne Referenz für das qPCR-Experiment ausgewählt.
Die einzurichtenden qPCR-Vertiefungen sind wie folgt:
1) NTC (No Template Control) dient der Überprüfung, ob Verunreinigungen im PCR-System vorliegen.
2) NRT (Keine Reverse Transkription) bezieht sich auf die Verwendung von RNA, die keiner Reverse Transkription unterzogen wurde, als Vorlage, die als Kontrolle für gDNA-Kontamination dient.
3) Die internes Referenzgen wird verwendet, um Unterschiede zu korrigieren, die durch unterschiedliche Anfangskonzentrationen der Proben verursacht werden.
4) Die Auswahl von Kontrollproben fällt im Allgemeinen in die folgenden Kategorien:
- Um die Auswirkung einer bestimmten Behandlung auf die Genexpression zu beurteilen, wird die unbehandelte Probe als Referenzprobe verwendet.
- Um die Unterschiede in der Genexpression zu verschiedenen Zeitpunkten festzustellen, wird die Probe zum Zeitpunkt 0 als Referenzprobe verwendet.
- Um die Unterschiede in der Genexpression zwischen verschiedenen Geweben zu vergleichen, wird ein Gewebe willkürlich als Referenzprobe ausgewählt.
Zu beachten ist hierbei, dass für jedes der oben genannten Materialien 3 PCR-Wells (1, 2, 3) angelegt wurden. Dabei handelt es sich um PCR-Duplikate, auch technische Replikate genannt, die dazu dienen, Betriebsfehler auszuschließen und die Amplifikationseffizienz genau zu bewerten. Zusätzlich müssen biologische Replikate angelegt werden, bei denen dasselbe Experiment mit unterschiedlichen Materialien (verschiedene Zeiten, Pflanzen, Chargen, Reaktionsplatten) durchgeführt wird, um die biologische Variabilität zu kalibrieren und zu analysieren, ob die Behandlung statistisch signifikant ist. In diesem Fall müssen sowohl die Versuchsgruppe als auch die Kontrollgruppe mindestens zwei weitere Sätze Arabidopsis-Proben (A, B, C) verarbeiten. Aus jedem Satz wird RNA extrahiert und rücktranskribiert, gefolgt von qPCR. Für die statistische Analyse wird der Durchschnitt der drei biologischen Replikate verwendet.
Ergebnisanalyse – ΔΔCt-Methode
Die Besonderheit der ΔΔCt-Methode besteht darin, dass sie sich bei der Berechnung ausschließlich auf die Ct-Werte stützt. Voraussetzung ist jedoch, dass die Amplifikationseffizienz des Zielgens und des Referenzgens relativ konsistent sein und beide im Bereich zwischen 90 und 110 % liegen sollten.
Die konkrete Berechnungsformel lautet wie folgt:
ΔCt = Ct (Zielgen) - Ct (Referenzgen)
ΔΔCt = ΔCt (Versuchsgruppe) - ΔCt (Kontrollgruppe)
RQ = 2^(-ΔΔCt)
Unter der Annahme, dass das obige Experiment die Wirkung der Lichtinduktion auf die Expression des Gens AtSUC2 in Arabidopsis untersucht hat, lauten die Ergebnisse der qPCR wie folgt:
Während der Berechnung berechnen wir zunächst den Durchschnitt der 2^-△Ct-Daten für die Kontrollgruppe (wie in der obigen Abbildung gezeigt, der 0,00116 beträgt). Dann teilen wir jeden Wert von 2^-△Ct durch diesen Durchschnitt, um den Wert von 2^-△△Ct zu erhalten. Schließlich ordnen wir diese Werte an, um den Mittelwert und die Standardabweichung zu erhalten, was darauf hinweist, dass der Expressionsgrad des Zielgens in der Versuchsgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe um das etwa 9,73-fache erhöht ist.
Die Ergebnisse werden mit der Software Graphpad wie folgt dargestellt:
Der mit dem T-Test der Software berechnete P-Wert beträgt 0,0024, also weniger als 0,05, was auf einen statistisch signifikanten Unterschied hinweist und bedeutet, dass die Ergebnisse zuverlässig sind.
Ergebnisanalyse – Duale Standardkurvenmethode
Da die Amplifikationseffizienz des Zielgens und des Referenzgens in der Praxis oft unterschiedlich ist, ist es notwendig, Primer neu zu entwickeln und Reaktionsbedingungen zu optimieren, um die gleiche Amplifikationseffizienz zu erreichen. Wir können jedoch auch eine bequemere Methode wählen, den Dual-Standard-Kurven-Ansatz.
Lassen Sie uns zunächst die Analysemethode der absoluten Quantifizierung verstehen. Die spezifischen Schritte bestehen darin, das Zielfragment durch PCR zu amplifizieren, dann das Zielfragment in einen Klonierungsvektor einzufügen, das rekombinante Plasmid zu extrahieren und nach der Sequenzierung, die seine Richtigkeit bestätigt, kann es als Standard verwendet werden. Die Menge an Plasmid-DNA kann mit Instrumenten wie Nanodrop gemessen werden, und die Kopienzahl wird mithilfe der Kopienzahl-Umrechnungsformel in spezifische Plasmidkopien umgewandelt. Danach wird die DNA nach einer Reihe von Verdünnungen amplifiziert. Eine Standardkurve wird mit dem Logarithmus der Standardkopienzahl als x-Achse und den gemessenen Ct-Werten als y-Achse erstellt. Basierend auf dem Ct-Wert der unbekannten Probe kann ihre absolute Kopienzahl berechnet werden.
Formel zur Berechnung der Kopienzahl:
Kopienzahl = (Masse ÷ relative Molekülmasse) × 6,02 × 10^23
Bei der Methode der dualen Standardkurve werden für das Zielgen und das Referenzgen getrennt Standardproben hergestellt, eine absolute Quantifizierung durchgeführt und Standardkurven erstellt. Nach der Berechnung der absoluten Kopienzahl der unbekannten Proben wird ein Vergleich durchgeführt, wodurch eine höhere Genauigkeit erreicht wird.
Die konkrete Berechnungsformel lautet wie folgt:
Q = Anzahl der Zielgenkopien / Anzahl der Referenzgenkopien
RQ = Q (experimentell) / Q (Kontrolle)
Im oben erwähnten Experiment, das die Wirkung der Lichtinduktion auf die Expression des Arabidopsis-AtSUC2-Gens untersucht, wurden Standardproben sowohl für AtSUC2 als auch für GAPDH konstruiert und die folgenden Standardkurven erstellt:
Die Ct-Werte für das Zielgen und das interne Referenzgen in den zu testenden Proben lauten wie folgt:
Während der Berechnung werden zunächst die Ct-Werte des Zielgens und des internen Referenzgens in die lineare Beziehung der Standardkurve eingesetzt, um die absoluten Kopienzahlen des Zielgens und des internen Referenzgens sowohl in der Versuchs- als auch in der Kontrollgruppe zu erhalten. Anschließend wird der Expressionsgrad des Zielgens mithilfe der Formel Q = Anzahl der Zielgenkopien / Anzahl der Referenzgenkopien normalisiert.Schließlich errechnet sich gemäß der Formel RQ = Q (experimentell) / Q (Kontrolle) ein RQ von 9,71, was bedeutet, dass der Expressionsgrad des Zielgens in der Experimentalgruppe 9,71-mal höher ist als in der Kontrollgruppe.
Die Ergebnisse werden mit der Software GraphPad wie folgt dargestellt:
Der mit dem T-Test der Software berechnete P-Wert beträgt 0,0008, also weniger als 0,05, was auf einen statistisch signifikanten Unterschied hinweist und bedeutet, dass die Ergebnisse zuverlässig sind.
Damit ist die qPCR-Datenanalyse für diese Sitzung abgeschlossen. Als Nächstes werde ich eine Reihe kostengünstiger Produkte empfehlen, mit denen Sie sicherstellen können, dass Ihre experimentellen Daten genauer und zuverlässiger sind. Kommen Sie vorbei und holen Sie sie ab!
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