Durchbruch durch Yeasen und Molefuture Biotechnology

Mit der rasanten Entwicklung der Biotechnologie hat die mRNA-Therapie als neue Behandlungsmethode aufgrund ihrer starken Programmierbarkeit und schnellen Reaktionsgeschwindigkeit viel Aufmerksamkeit auf sich gezogen. In Bereichen wie mRNA-Impfstoffen und Gentherapie ist die effiziente Synthese hochwertiger mRNA ein entscheidender Schritt zum Erreichen therapeutischer Ziele. In diesem Prozess spielt die T7-RNA-Polymerase eine entscheidende Rolle, da sie die In-vitro-Synthese von mRNA effizient katalysieren kann.

Das dsRNA-Nebenproduktproblem der T7-RNA-Polymerase

Obwohl die T7-RNA-Polymerase eine wichtige Rolle bei der mRNA-Synthese spielt, entsteht bei der eigentlichen Operation häufig doppelsträngige RNA (dsRNA) als Nebenprodukt. Die Anwesenheit von dsRNA verringert nicht nur die Ausbeute und Reinheit der mRNA, sondern kann auch unspezifische Immunreaktionen auslösen, die die Wirksamkeit und Sicherheit beeinträchtigen. Daher ist die Reduzierung der dsRNA-Produktion zu einem dringenden Bedürfnis der Industrie geworden. Derzeitige Methoden zur Reduzierung von dsRNA umfassen hauptsächlich die Optimierung der Reaktionsbedingungen und den Einsatz von Hilfsenzymen. Obwohl diese Methoden die Produktion von dsRNA bis zu einem gewissen Grad reduzieren können, sind sie häufig mit Problemen wie einem komplexen Betrieb und höheren Kosten verbunden.

Warum sollten wir T7-RNA-Polymerase-Engineering betreiben?

Eine grundlegendere Lösung besteht darin, die T7-RNA-Polymerase direkt zu modifizieren, um die dsRNA-Produktion zu reduzieren. Enzymgesteuerte Evolutionstechniken können ihre katalytischen Eigenschaften verbessern und die Reinheit und Ausbeute der Produkte erhöhen, indem sie die Aminosäuresequenz oder -struktur des Enzyms präzise verändern. Bei der T7-RNA-Polymerase kann eine gezielte Modifikation nicht nur die dsRNA-Produktion reduzieren, sondern auch die Gesamteffizienz und -qualität der mRNA-Synthese verbessern.

Als Lieferant von Rohstoffen für die mRNA-In-vitro-Synthese bietet Yeasen Biotechnologie und seine Tochtergesellschaft Molefuture Biotechnologie, haben hat eine neuartige T7-RNA-Polymerase entwickelt – unter Verwendung der ZymeEditor-Plattform für gezielte Evolution. Um die Produktion von Nebenprodukten wie dsRNA während In-vitro-Transkriptionsprozessen zu minimieren, hat das Evolutionsteam die T7-RNA-Polymerase durch eine Kombination aus rationalem Design und gezieltem Screening entwickelt.

Wie entsteht dsRNA?

Laut Literaturberichten hat die Produktion des Nebenprodukts dsRNA hauptsächlich zwei Ursachen (Abbildung 1): Die erste ist während des Übergangs der T7-RNA-Polymerase von der Initiationskonformation zur Elongationskonformation in den frühen Stadien der Transkription, wobei der ternäre Transkriptionskomplex zur Dissoziation neigt [1], was zur Freisetzung einer großen Anzahl kurzer RNA-Ketten (abortive RNA) mit Längen um die 20 nt in das System führt. Diese RNA-Ketten fungieren als „Primer“, die sich komplementär mit langen RNA-Ketten paaren, und verlängern sich unter der Einwirkung der RNA-abhängigen RNA-Polymerase-Aktivität (RDRP-Aktivität) der T7-RNA-Polymerase, um dsRNA zu produzieren [2,3]. Die zweite Ursache wird durch die terminale Ribonukleotidtransferaktivität der T7-RNA-Polymerase ausgelöst. Wenn die Transkriptionsreaktion das Ende der linearen Vorlage erreicht, kann die T7-RNA-Polymerase zufällig mehrere Ribonukleotide ohne Vorlagenabhängigkeit hinzufügen. Diese Ribonukleotide, die „random primers“ bilden, können sich umkehren und komplementär mit der Ziel-mRNA-Region paaren, wodurch dsRNA entsteht. Die durch Looping entstehende dsRNA wird als Loopback-dsRNA bezeichnet [3,4]. Um dsRNA-Nebenprodukte zu reduzieren, liegt der Schwerpunkt der T7-RNA-Polymerase-Modifikation daher auf der Stabilisierung des frühen Transkriptions-Ternärkomplexes oder der Schwächung der terminalen Transferaktivität und der RNA-abhängigen RNA-Polymerase (RDRP). Aktivität der T7-RNA-Polymerase.

Abbildung 1. Schematische Darstellung der Energiebarriere und des dsRNA-Bildungsprinzips (unveröffentlichte Daten)

Wie man überwindet Energiebarriere der T7-RNA-Polymerase Konformationsübergang?

Durch Struktur- und Freienergieanalyse entdeckte das Team einerseits, dass es mit den Konformationsänderungen der T7-RNA-Polymerase auch zu einer Energieänderung kommt. Die Freienergie der Elongationskonformation ist deutlich höher als die der Initiationskonformation, was darauf hindeutet, dass der Transkriptionsprozess eine höhere Energiebarriere überwinden muss, um vollständige mRNA-Ketten zu produzieren. Eine hohe Energiebarriere ist für einen reibungslosen Konformationsübergang ungünstig. Daher nutzte das Team rational Screening-Methoden zur Identifizierung von über 20 Hotspot-Aminosäuren und Aufbau entsprechender Sättigungsmutagenese-Bibliotheken.

So ändern Sie die Terminaler Transfer und RDRP-Aktivitäten der T7-RNA-Polymerase

Andererseits ist es angesichts der begrenzten Berichte über die Funktionen, Stellen und Strukturdomänen im Zusammenhang mit den terminalen Transfer- und RDRP-Aktivitäten der T7-RNA-Polymerase und weil diese beiden funktionell ähnlichen Aktivitäten wahrscheinlich Schlüsselstellen mit der Hauptreaktion der T7-RNA-Polymerase teilen – der Transkriptionsaktivität (d. h. DNA-abhängige RNA-Polymerisationsaktivität, DDRP) – schwierig, Hotspot-Aminosäuren für eine zielgerichtete Modifikation zu finden. Daher erstellte das Team gleichzeitig mehrere zufällige Mutationsbibliotheken auf der Grundlage fehleranfälliger PCR, kombiniert mit der Hochdurchsatz-Evolutionskapazität der ZymeEditor-Plattform, was zu einer Diversität von über 10^6 für jede einzelne Bibliothek führte.

Sondenbasierte Entdeckung idealer T7-RNA-Polymerase

Um die Produktion der T7-RNA-Polymerase auszugleichen und den Gehalt an dsRNA in der In-vitro-Transkriptionsreaktion zu überwachen, entwickelte das Team unter Bezugnahme auf optimierte Transkriptionsvorlagen sorgfältig mehrere Fluoreszenz Sonden, die auf verschiedene Bereiche der Ziel-mRNA-Produkte abzielen. Diese Sonden verknüpfen Informationen wie Reaktionsausbeute, Integrität und dsRNA-Gehalt innerhalb des Systems mit Fluoreszenzsignalen. Je stärker die Fluoreszenzintensität des Systems, desto vorteilhafter ist die Leistung des Mutanten. Theoretisch kann diese Screening-Methode Mutanten basierend auf der Fluoreszenzintensität verschiedener Sonden einstufen, wodurch T7-RNA-Polymerase-Mutanten mit hoher Ausbeute oder reduzierter abortiver RNA sowie Mutanten mit verbesserter Integrität oder reduzierter Loopback-dsRNA erhalten werden. Wenn die Reaktionsvorlage durch RNA ersetzt wird, können auch Mutanten mit reduzierter RDRP-Aktivität negativ gescreent werden, wodurch die Vorlagenselektivität der T7-RNA-Polymerase verbessert wird. Zusätzlich können durch Hinzufügen modifizierter Nukleotide, Cap-Analoga und Erhöhen der Reaktionstemperatur im Tröpfchenreaktionssystem weitere Screenings durchgeführt werden, um T7-RNA-Polymerase-Mutanten auszuwählen, die nicht-natürliche Substrate tolerieren und eine verbesserte thermische Stabilität aufweisen.

So screenen Sie am besten T7-RNA-Polymerase?

Basierend auf der Größe der Bibliotheken, das Team entwickelte Ultra-Hochdurchsatz-Screening-Prozesse auf Basis der fluoreszenzaktivierten Tröpfchensortierung (FADS) und Hochdurchsatz-Screening-Prozesse auf Basis traditioneller Mikroplattenmethoden (MTPS).In mehreren Versuchsrunden wurden insgesamt über 10^7 Mutanten untersucht, was zu mehreren Mutanten mit deutlich reduziertem dsRNA-Gehalt führte. Unter ihnen zeigten einige Mutanten einen durch abortive RNA verursachten Rückgang der dsRNA in der Reaktion, was darauf hindeutet, dass die Verlängerungskonformation dieser Polymerasemutanten stabiler ist. Einige Mutanten zeigten einen Rückgang des Loopback-dsRNA-Gehalts in der Reaktion, was auf eine Abschwächung der terminalen Transferaktivität oder RDRP-Aktivität in diesen Mutanten hindeutet.

Da die Leistungsvorteile der oben genannten Mutanten auf unterschiedlichen Mechanismen beruhen, hat DNA-Shuffling-Bibliotheken erstellt, die auf diese abzielen. Nach dem Screening endlich leistungsstärkere Mutanten erhalten mit extrem geringer dsRNA-Erzeugung, ohne die Ausbeute und mRNA-Integrität zu beeinträchtigen (Abbildung 2). Die Ausbeute einer von Moderna entdeckten Mutante G47A+884G war jedoch beeinträchtigt^[5] (unveröffentlicht).

Abbildung 2. Enzymevolutionsprozess und Charakterisierung der Mutantenleistung

(unveröffentlicht)

Analyse der dsRNA-Generierung durch T7-RNA-Polymerase Varianten?

Nach der quantitativen Analyse, wie in Abbildung 3 dargestellt, unter Verwendung einer 9 kb Transkriptionsvorlage unter Co-Transkriptions-Capping-Bedingungen produzierte die Wildtyp-T7-RNA-Polymerase bei Verwendung natürlicher Nukleotide ungefähr 2,9 ng/μg dsRNA, während eine kommerzielle T7-Enzym produzierte etwa 0,18 ng/μg dsRNA. Die dsRNA-Produktion jeder T7-RNA-Polymerase-Variante konstruiert wurde, war kleiner als 0,10 ng/μg. Insbesondere Variante betrug nur 0,015 ng/μg, fast 200-mal niedriger als beim Wildtyp und 12-mal niedriger als beim kommerziellen Produkt. Nach wiederholten Tests wurde der Leistungsvorteil der Varianten bei der Reduzierung von dsRNA unter verschiedenen Reaktionsbedingungen durchgängig beobachtet, was auf eine gute Systemkompatibilität dieser Mutanten hinweist und eine Grundlage für eine weitere Reduzierung der dsRNA-Produktion durch Reaktionspuffer legt Optimierung. Darüber hinaus wurden durch FADS-Screening auch mehrere Varianten mit verbesserter Produktintegrität und thermischer Stabilität erhalten, die den Anforderungen einer größeren Bandbreite von In-vitro-Transkriptionsanwendungen gerecht werden können.

Abbildung 3. Auswertung der dsRNA-Erzeugung durch T7-RNA-Polymerasevarianten, ermittelt mit dem Yeasen-ELISA-Kit für doppelsträngige RNA (dsRNA) und der J2-Antikörper-Dot-Blot-Analyse.

Mittlerweile haben mehrere Partner die T7-RNA-Polymerase-Varianten bereits ausprobiert und wir haben von ihnen großes Lob bekommen. Der Einsatz des neuen Enzyms vereinfacht den mRNA-Reinigungsprozess, steigert die Arbeitseffizienz und zeigt in mehreren Anwendungsszenarien eine herausragende Leistung.

Für diese Varianten liegen Patentanmeldungen vor und wir freuen uns über Gespräche hinsichtlich einer Technologiekooperation und Lizenzierung.

Über Molefuture Biotechnology

Molefuture Biotechnology ist eine Tochtergesellschaft von Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. ist auf die Bereitstellung maßgeschneiderter Lösungen zur Enzymmodifizierung auf Basis der Enzymevolutionstechnologie spezialisiert.Nutzung der Ressourcen von Yeasen Biotechnologie: Molefuture arbeitet auf sechs großen Technologieplattformen: der innovativen Enzymevolutionsplattform ZymeEditor, einer Multi-Host-Hocheffizienz-Expressionsplattform, einer Fermentationsprozess-Entwicklungsplattform, einer Aufreinigungsprozess-Entwicklungsplattform, einer ultrareinen Enzymproduktionsplattform und einer Enzymanalyse- und Qualitätskontrollplattform. Mit diesen sechs Technologieplattformen kann Molefuture ein komplettes Set an maßgeschneiderten Lösungen anbieten, darunter enzymgesteuerte Evolution, Entwicklung neuer Enzyme, Entwicklung von Enzymprozessen und Scale-up-Produktion auf GMP-Niveau, um den Anwendungsanforderungen von Enzymen in Bereichen wie In-vitro-Diagnostik, Biomedizin, synthetische Biologie, medizinische Ästhetik, pharmazeutische Zwischenprodukte usw. gerecht zu werden.

Bestellinformationen

Nachfolgend sind repräsentative Produkte von Yeasen aufgeführt. Weitere Größen sind verfügbar. Unsere Produkte sind optimal aufeinander abgestimmt, um eine überragende Leistung und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Wir können auch kundenspezifische Dienstleistungen anbieten. Wenn Sie an einem Produkt interessiert sind, das nicht gezeigt wird, kontaktieren Sie uns und wir werden mit Ihnen zusammenarbeiten, um Ihre Anforderungen zu erfüllen.

Zum Thema Lesen:

Weitergabe des Validierungsberichts des ELISA-Kits für doppelsträngige RNA (dsRNA), um die Standardisierung der dsRNA-Erkennung zu fördern.

Quellen:

[1] Sousa R, Mukherjee S. T7 RNA-Polymerase[J]. Fortschritte in der Nukleinsäureforschung und Molekularbiologie, 2003: 1-41.

[2] Steitz T A. Die strukturellen Veränderungen der T7-RNA-Polymerase von der Transkriptionsinitiierung bis zur Elongation[J]. Current opinion in structural biology, 2009, 19(6): 683-690.

[3] Vallejo D, Nikoomanzar A, Paegel BM, et al. Fluoreszenzaktivierte Tröpfchensortierung für die gerichtete Evolution einzelner Zellen[J]. ACS synthetic biology, 2019, 8(6): 1430-1440.

[4] Gholamalipour Y, Karunanayake Mudiyanselage A, Martin C T. 3'-Endadditionen durch T7-RNA-Polymerase sind RNA-selbsttemplativ, distributiv und vielfältig im Charakter – RNA-Seq-Analysen[J]. Nucleic acid research, 2018, 46(18): 9253-9263.

[5] Dousis A, Ravichandran K, Hobert EM, et al. Eine gentechnisch veränderte T7-RNA-Polymerase, die mRNA ohne immunstimulierende Nebenprodukte produziert[J]. Nature Biotechnology, 2023, 41(4): 560-568.