Suchen Sie nach einer zuverlässigen Methode zum Nachweis von dsRNA-Resten während der mRNA-In-vitro-Transkription? Dann sind Sie mit dem Double-stranded RNA (dsRNA) ELISA Kit genau richtig. Da jedoch mehrere kommerzielle Kits erhältlich sind, ist es wichtig zu beachten, dass Validierungsdaten möglicherweise nicht immer öffentlich verfügbar sind, was zu Inkonsistenzen beim dsRNA-Nachweis führt. Aus diesem Grund veröffentlichen wir unseren Validierungsbericht zum Double-stranded RNA (dsRNA) ELISA Kit, der Spezifität, Präzision, Genauigkeit, Empfindlichkeit und Haltbarkeit abdeckt. Dieser Bericht dient als Referenzhandbuch zur Validierung von dsRNA-Restnachweismethoden, die auf bestimmte experimentelle Bedingungen und regulatorische Pharmakopöestandards zugeschnitten sind. Bitte erfahren Sie mehr über unseren Validierungsbericht um die Standardisierung der dsRNA-Erkennung voranzutreiben.
Doppelsträngige RNA (dsRNA) ELISA KEs
Hintergrund:
Das ELISA-Kit für doppelsträngige RNA (dsRNA) ist ein Reagenzienkit zum Nachweis der restlichen dsRNA, die während des mRNA-Transkriptionsprozesses in vitro entsteht. Dieses Kit verwendet das experimentelle Prinzip des Doppelantikörper-Sandwich-Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) und das Biotin-Streptavidin-Amplifikationssystem und ermöglicht den empfindlichen Nachweis von restlicher dsRNA in Proben.
Die zusammengefassten Daten enthalten Validierungsparameter zu Spezifität, Präzision, Genauigkeit, Sensitivität und Haltbarkeit. Der Bericht dient als Referenzhandbuch und fordert die Benutzer auf, dsRNA-Restnachweismethoden zu validieren, die auf ihre spezifischen Versuchsbedingungen zugeschnitten sind und den behördlichen Pharmakopöestandards entsprechen.
Materialen und Methoden:
Ausrüstung: Doppelsträngige RNA (dsRNA) ELISA-Kit: Kat.-Nr. 36717ES (YEASEN). Das Kit enthält vier verschiedene Typen von dsRNA-Standardproben. Benutzer haben die Möglichkeit, den Standardprobentyp auszuwählen, der zu ihrem spezifischen Verfahren zur Generierung der Standardkurve passt, wodurch die Notwendigkeit entfällt, alle Proben vorzubereiten und zu testen.
Methoden: Die für das Experiment erforderlichen Materialien und Verfahrensschritte werden überwiegend von
Ergebnisse
- Linearität von dsRNA-Standards
In diesem Bericht wurden Standardkurven für alle vier unterschiedlichen Typen von dsRNA-Standards mit einer Länge von jeweils 300 bp entwickelt. Diese Standards umfassen STD1, unveränderte dsRNA; STD2, Pseudo-UTP-modifizierte dsRNA; STD3, N1-Me-Pseudo-UTP-modifizierte dsRNA; und STD4, 5-OMe-UTP-modifizierte dsRNA. Jeder Typ von dsRNA-Standard weist eine ausgezeichnete Linearität der Verdünnung mit R2 > 0,99 und einem Variationskoeffizienten (CV) der gemessenen Konzentration von weniger als 10 % auf, wie in Tabelle 1 bis Tabelle 5 gezeigt.
| STD-Name | UTP-Typ | Linearität der Verdünnung (R2＞0,99) | Lebenslauf |
| STD1 | UTP | 0.0156-1 pg/µL | ＜10 % |
| STD2 | pUTP | 0,0156–1 pg/µl | ＜10 % |
| STD3 | N1-Me-pUTP | 0,0312–1 pg/µl | ＜10 % |
| STD4 | 5-OMe-UTP | 0,0625–1 pg/µl | ＜10 % |
Tabelle 1. Die Linearität verschiedener dsRNA-Standards.
| STD1-Konz.N. (pg/µL) | Gemessener Mittelwert (pg/µL) | Erholung | Lebenslauf |
| 1 | 1,0001 | 100,0 % | 3,1 % |
| 0,5 | 0,4994 | 99,9 % | 2,4 % |
| 0,25 | 0,2516 | 100,7 % | 3,3 % |
| 0,125 | 0,1227 | 98,1 % | 0,5 % |
| 0,0625 | 0,0640 | 102,5 % | 3,2 % |
| 0,0312 | 0,0309 | 99,2 % | 1,3 % |
| 0,0156 | 0,0157 | 100,4 % | 3,2 % |
| 0 | / | / | / |
Tabelle 2.Die Genesung und der Lebenslauf von verdünntem STD1
| STD2-Konz.N. (pg/µL) | Gemessener Mittelwert (pg/µL) | Erholung | Lebenslauf |
| 1 | 1,0001 | 100,0 % | 0,7 % |
| 0,5 | 0,4994 | 99,9 % | 0,1 % |
| 0,25 | 0,2514 | 100,6 % | 0,9 % |
| 0,125 | 0,1232 | 98,6 % | 2,5 % |
| 0,0625 | 0,0635 | 101,6 % | 1,1 % |
| 0,0312 | 0,0312 | 99,9 % | 0,5 % |
| 0,0156 | 0,0155 | 99,6 % | 0,0 % |
| 0 | / | / | / |
Tabelle 3. Die Erholung und der Lebenslauf von verdünntem STD2
| STD3-Konz. (pg/µL) | Gemessener Mittelwert (pg/µL) | Erholung | Lebenslauf |
| 2 | 2,0031 | 100,2 % | 1.6 % |
| 1 | 0,9880 | 98,8 % | 2,4 % |
| 0,5 | 0,5188 | 103,8 % | 1,2 % |
| 0,25 | 0,2383 | 95,3 % | 2,2 % |
| 0,125 | 0,1242 | 99,4 % | 0,1 % |
| 0,0625 | 0,0629 | 100,7 % | 1,8 % |
| 0,0312 | 0,0361 | 115,7 % | 1,6 % |
| 0 | / | / | / |
Tabelle 4. Die Erholung und der Lebenslauf von verdünntem STD3
| STD4-Konz. (pg/µL) | Gemessener Mittelwert (pg/µL) | Erholung | Lebenslauf |
| 4 | 4,0096 | 100,2 % | 1,9 % |
| 2 | 1,9940 | 99,7 % | 0,7 % |
| 1 | 0,9977 | 99,8 % | 0,1 % |
| 0,5 | 0,5108 | 102.2 % | 0,1 % |
| 0,25 | 0,2454 | 98,2 % | 5,6 % |
| 0,125 | 0,1207 | 96,5 % | 2,8 % |
| 0,0625 | 0,0624 | 99,9 % | 0,3 % |
| 0 | / | / | / |
Tabelle 5. Die Erholung und der Lebenslauf von verdünntem STD4
-
Spezifität
- Spezifitätsanalyse mit dsRNA, ssRNA, dsDNA und ssDNA.
- Die Spezifität wurde durch die Länge der dsRNAs nicht beeinflusst.
-
AGenauigkeit
Zugabe von 0,5 pg/µL STD1 zu einer bekannten mRNA-Probe mit einem dsRNA-Gehalt von 0,36 pg/μL wurde in drei verschiedenen Volumenverhältnissen (1:1, 1:20, 1:250) durchgeführt. In allen Fällen lagen die Spike-Wiederfindungsraten im Bereich von 80-120 %.
Die Spike-Wiederherstellungsrate wird wie folgt berechnet: Spike Erholung Rate=(Gemessen Konzentration nach Spiking×Gesamt Volumen von gespickt Probe−Gemessen Konzentration von Die Probe×Gesamt Volumen von Die Probe)/(Theoretische Konzentration von Die Spitze×Volumen von Die Spitze)×100 %
| Proben | Volumenverhältnis von STD1/Probe | Gemessene dsRNA (pg/µL) | Spitze Erholung Rate |
| Probe (TS) | / | 0,36 | / |
| TS+0,5 pg/µl STD1 | 1:1 | 0,769 | 81 % |
| TS+0,5 pg/µl STD1 | 1:20 | 0,777 | 82 % |
| TS+0,5 pg/µl STD1 | 1:250 | 0.803 | 82 % |
Tabelle 6. Die Spike-Wiederherstellungsrate Analyse
-
Präzision
- Intra-Assay-Präzision
Für jede der vier dsRNA-Standardproben wurden Experimente auf drei Konzentrationsstufen (hoch, mittel und niedrig) durchgeführt. Innerhalb eines einzelnen Experiments wurde jede Konzentrationsprobe achtmal wiederholt getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass der Variationskoeffizient (CV) unter 15 % liegt. was auf eine gute Intra-Assay-Präzision hinweist.
| STD1 | |||
| Theoretisch Konz. (pg/µL) | Replikate | Gemessener Mittelwert (pg/µL) | Lebenslauf |
| 1 | 8 | 1,0002 | 3,11 % |
| 0,125 | 8 | 0,1230 | 0,46 % |
| 0,0156 | 8 | 0,0164 | 3,18 % |
| STD2 | |||
| Theoretisch Konz. (pg/µL) | Replikate | Gemessener Mittelwert (pg/µL) | Lebenslauf |
| 1 | 8 | 1,0001 | 0,65 % |
| 0,125 | 8 | 0,1231 | 2,46 % |
| 0,0156 | 8 | 0,0162 | 0,02 % |
| STD3 | |||
| Theoretisch Konz. (pg/µL) | Replikate | Gemessener Mittelwert (pg/µL) | Lebenslauf |
| 2 | 8 | 2,0022 | 1,58 % |
| 0,25 | 8 | 0,2444 | 2,17 % |
| 0,0312 | 8 | 0,0328 | 1,64 % |
| STD4 | |||
| Theoretisch Konz. (pg/µL) | Replikate | Gemessener Mittelwert (pg/µL) | Lebenslauf |
| 8 | 8 | 8.0803 | 0,27 % |
| 1 | 8 | 0,9650 | 0,12 % |
| 0,125 | 8 | 0,1322 | 2.76 % |
Tabelle 7. Intraassay-Präzisionsanalyse
- Inter-Assay-Präzision
Drei Experimente wurden mit Kits von 3 durchgeführt Chargen. In jedem Experiment wurden hohe, mittlere und niedrige Konzentrationen ausgewählt und dreimal für jede der vier dsRNA-Standardproben getestet, mit acht Replikaten. Folglich wurden bei jedem 24 Datenpunkte erfasst. Konzentrationsniveau, die dann für die Analyse des Variationskoeffizienten (CV) verwendet wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass der CV für jede Konzentration der Standards unter 15 % lag.
| STD1 | |||
| Theoretisch Konz. (pg/µL) | Unabhängige Tests/Replikate | Gemessener Mittelwert (pg/µL) | Lebenslauf |
| 1 | 3/8 | 1,0007 | 2,38 % |
| 0,125 | 3/8 | 0,1186 | 3,20 % |
| 0,0156 | 3/8 | 0,0173 | 1,27 % |
| STD2 | |||
| Theoretisch Konz. (pg/µL) | Unabhängige Tests/Replikate | Gemessener Mittelwert (pg/µL) | Lebenslauf |
| 1 | 3/8 | 0,9987 | 0,09 % |
| 0,125 | 3/8 | 0,1269 | 1,06 % |
| 0,0156 | 3/8 | 0,0151 | 0,52 % |
| STD3 | |||
| Theoretisch Konz. (pg/µL) | Unabhängige Tests/Replikate | Gemessener Mittelwert (pg/µL) | Lebenslauf |
| 2 | 3/8 | 2,0012 | 2,37 % |
| 0,25 | 3/8 | 0,2415 | 0,14 % |
| 0,0312 | 3/8 | 0,0330 | 1,81 % |
| STD4 | |||
| Theoretisch Konz. (pg/µL) | Unabhängige Tests/Replikate | Gemessener Mittelwert (pg/µL) | Lebenslauf |
| 8 | 3/8 | 7,9735 | 1,89 % |
| 1 | 3/8 | 1,0225 | 0,13 % |
| 0,125 | 3/8 | 0.1227 | 5,63 % |
Tabelle 8. Inter-Assay-Präzisionsanalyse
-
Empfindlichkeit
- LOD
Die Nachweisgrenze der Bausatz wird bestimmt, indem zum Mittelwert der Blindwerte die doppelte Standardabweichung addiert wird. Durch Messen der OD von 24 Blindproben, Berechnen ihres Mittelwerts und ihrer Standardabweichung und Anwenden dieser Werte auf die angepasste Kurve erhält man die entsprechende Nachweisgrenze wird erhalten.
|
| Außen |
| ||
| dsRNA Standard | Mittelwert von Blank | SD von Blank | Mittelwert von Blank+2SD | LOD |
| STD1 | 0,016 | 0,00048 | 0,01696 | ≤ 0,001 pg/µl |
| STD2 | 0,016 | 0,00072 | 0,01744 | ≤ 0,001 pg/µl |
| STD3 | 0,034 | 0,00119 | 0,03638 | ≤ 0,001 pg/µl |
| STD4 | 0,115 | 0,00290 | 0,1208 | ≤ 0,01 pg/µl |
Tabelle 9. LOD-Analyse
- LOQ
Die quantitative Grenze der Bausatz wird durch Verdünnung des niedrigsten Konzentrationspunkts der Standardkurve auf noch niedrigere Werte ermittelt, wodurch ein CV < 20 % bei der niedrigsten Konzentration sichergestellt und dadurch der quantitative Schwellenwert definiert wird. Die LOQ ist wie folgt.
| dsRNA Standard | LOQ | Replikate | Lebenslauf (%) | Erholung (%) |
| STD1 | 0,0156 pg/µL | 24 | ＜10 % | 80 – 120 % |
| STD2 | 0,0312 pg/µL | 24 | ＜10 % | 80 – 120 % |
| STD3 | 0,0156 pg/µL | 24 | ＜10 % | 80 – 120 % |
| STD4 | 0,125 pg/µL | 24 | ＜10 % | 80 – 120 % |
-
DHaltbarkeit
- Entstörung von IVT-Materialien
Dieser Test Ziel war es, die Auswirkungen verschiedener Enzyme, Puffer usw. zu bewerten, die dem mRNA Probe auf den dsRNA-Nachweis durch das Kit.
Hinzufügen spezifischer Konzentrationen von T7-RNA-Polymerase, RNAse-Inhibitor, IPPA (anorganische Pyrophosphatase), DNase I, VCE (Vaccinia-Capping-Enzym), 2'-O-Methyltransferase (MT), 1×IVT-Puffer und 1 mM Natriumcitrat zu einer bereitgestellten mRNA-Probe und anschließende Verwendung von STD3 für die Standardkurvenvorbereitung und Probenuntersuchung ermöglichte die Bewertung der Fähigkeit des Kits, dsRNA-Gehalt in diesen zu erkennen Proben. Die Ergebnisse zeigen, dass die Anwesenheit von acht verschiedenen Enzymen und Puffern die genaue Erkennung von dsRNA nicht beeinträchtigte. Darüber hinaus lagen die beobachteten Rückgewinnungsraten im Bereich von 80 % bis 120 %.
| IVT-Materialien | dsRNA Gemessen (pg/µL) | Erholung |
| Keiner | 0,6057 | 100 % |
| T7-RNA-Polymerase (15 μg/ml) | 0,5411 | 89,32 % |
| Muriner RNase-Inhibitor (27,5 μg/ml) | 0,5142 | 84,88 % |
| Anorganische Pyrophosphatase (IPPA 10 μg/ml) | 0,7132 | 117,7 % |
| DNase I (13,75 μg/ml) | 0,6077 | 100,32 % |
| Vaccinia-Capping-Enzym (10 μg/ml) | 0,6563 | 108,3 % |
| 2´-O-Methyltransferase (10μg/mL) | 0,5776 | 95,4 % |
| 1×IVT-Puffer | 0,5003 | 82,6 % |
| 1 mM Natriumcitrat | 0,6251 | 103,2 % |
Tabelle 11. Die Rückgewinnung von verdünntem STD3, das mit IVT-Materialien versetzt wurde
- Temperatur dHaltbarkeit
Die Kits wurden in beiden 4°C und 37°C um die Konzentrationsschwankungen des dsRNA-Standards nach 7 Tagen festzustellen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Abweichungen alle innerhalb von 20 % liegen.
| dsRNA Standard | dsRNA Gemessen (pg/μL) Tag 0 | Die Abweichungen nach 7 Tagen bei 4°C |
| STD1 | 1 | 10 % |
| STD2 | 1 | 5 % |
| STD3 | 2 | 7 % |
| STD4 | 4 | 11 % |
| dsRNA Standard | dsRNA Gemessen (pg/µL) | Die Abweichungen nach 7 Tagen bei 37°C |
| STD1 | 1 | 18 % |
| STD2 | 1 | 4 % |
| STD3 | 2 | 5 % |
| STD4 | 4 | 8 % |
Tabelle 12. Temperaturbeständigkeitsanalyse
Verwandtes Produkt:
| Produktname | Artikelnummer | Technische Daten |
| Doppelsträngige RNA (dsRNA) ELISA-Kit | 36717ES | 48Z/96Z |
| CleaScrip™ T7 RNA-Polymerase (niedrige ds-RNA, 250 U/μL) | 10628ES | 10/100 KU |
| T7-RNA-Polymerase GMP-Qualität (250 U/µL) | 10625ES | 10/100 KU |
Weiterführende Literatur:
Das doppelsträngige RNA (dsRNA)-ELISA-Kit wurde in Verbindung mit der J2-Antikörper-Dot-Blot-Methode verwendet, um T7-RNA-Polymerase-Mutanten mit niedrigem dsRNA-Gehalt zu validieren.
Quellen:
- ICH, 2022: Analytical Method Validation Q2, Entwurfsversion.
- NMPA, 2007: Allgemeine Grundsätze für die Bewertung der Validierung analytischer Methoden für die Qualitätskontrollanalyse biologischer Produkte
- Chinesische Arzneibuchkommission (ChPC), 2020: Chinesisches Arzneibuch, Teil vier: Richtlinien zur Validierung quantitativer Analysemethoden für biologische Proben