Entwicklung der T7-RNA-Polymerase (niedrige dsRNA) mit niedrigerer terminaler Transferase- und RDRP-Aktivitäten durch Modeerscheinungen und semi-rationales Design.

In den letzten Jahren haben mRNA-basierte Medikamente erhebliche Aufmerksamkeit erregt und den Forschungsschwerpunkt auf sich gezogen. T7 RNAP ist bekannt für seine Einfachheit und Fähigkeit, die RNA-Synthese mit hoher Ausbeute zu katalysieren und Genauigkeit in vitro. Während des Transkriptionsprozesses kann T7 RNAP jedoch Nebenprodukte wie abortive kurze RNAs, vorzeitig beendete RNAs und 3'-verlängerte RNAs produzieren, was günstige Bedingungen für die Bildung von dsRNA schafft. Daher ist die Reduzierung der Produktion von dsRNA in praktischen Anwendungen zu einem dringenden Bedürfnis geworden.

Kürzlich wurde eine bahnbrechende Studie mit dem Titel „FADS und semi-rationales Design modifizierten die T7-RNA-Polymerase und reduzierten so die dsRNA-Produktion bei niedrigeren Terminaltransferase- und RDRP-Aktivitäten." wurde online von Yeasen und dem Molefuture-Team veröffentlicht. Den Forschern gelang es, T7 RNAP so zu verändern, dass die Produktion von dsRNA-Nebenprodukten während der Transkription deutlich reduziert wurde, und zwar durch eine Kombination aus gerichteter Evolution und semi-rationalem Design auf 1,8 % des Wildtyp-Enzyms.

FADS-basiertes Screening von T7-RNAP

Für das Screening von T7-RNAP wurde FADS (Fluoreszenz-aktivierte Tröpfchensortierung) gewählt, um den hohen Durchsatzanforderungen der Proteinentwicklung gerecht zu werden. Um eine vorzeitige Fragmentierung der Zellen zu verhindern, verwendeten die Forscher einen PDMS-Chip mit zwei wässrigen Phasen, bei dem Lysozym mit den Zellen auf dem Chip vermischt wurde und seine Aktivität innerhalb der Tröpfchen ausübte. Abbildung 1. Die Forscher erzeugten mehrere zufällige Mutantenbibliotheken mit einer Diversität von 10⁵ bis 10⁶, Nach dem Screening wurden 10 dominante Varianten identifiziert und als Mut1 bis Mut10 bezeichnet.  Wie in Abbildung 2E Und Abbildung 2Fwar der dsRNA-Gehalt von Mut1, Mut7 und Mut9 signifikant niedriger als der des Wildtyps

Abbildung 1. Übersicht über das FADS

Abbildung 2. Zufälliges Bibliotheksscreening und Variantenbewertung

Semirationales Design von T7 RNAP

Forscher führte eine semi-rationale Design-Exploration durch, erstellte zehn gesättigte Einzelstellenbibliotheken und verwendete die traditionelle Mikrotiterplatten-basierte Dual-Probes-Methode für das Screening (Abbildung 3). Die hinzugefügte 5'-Ende-Sonde wird zur Erkennung der RNA-Ausbeute eingesetzt.

Abbildung 3. Strukturorientiertes semi-rationales Design zur Verringerung von dsRNA

Nach der Untersuchung von über 1000 Mutanten identifizierte sechs Kandidaten: Mut11 (K180E), Mut12 (S228F), Mut13 (G238L), Mut14 (A70Q), Mut15 (A383H) und Mut16 (I743L). Die Gesamt-RNA-Ausbeute aller sechs Mutanten unterschied sich nicht signifikant vom Wildtyp, was auf eine vergleichbare Gesamttranskriptionseffizienz hindeutet. Wie erwartet war der dsRNA-Gehalt von Mut11 und Mut14 im Vergleich zum Wildtyp signifikant niedriger (Abbildung 4).

Abbildung 4. Mikrotiterplatten-Screening und Variantenbewertung

Mut17 aus DNA-Shuffling ergibt weniger dsRNA

Um das T7-RNAP weiter zu optimieren, wurden die vier Varianten mit niedrigem dsRNA-Gehalt ausgewählt, die gleichzeitig die Produktionsanforderungen erfüllen.Anschließend erstellten die Forscher eine DNA-Shuffling-Bibliothek und durchsuchten diese mit Mikrotiterplatten. Dabei identifizierten sie eine Variante namens Mut17 (A70Q/F162S/K180E), die im Vergleich zu ihrer ursprünglichen T7-RNAP eine geringere dsRNA-Produktion aufwies. Anschließend analysierten sie die Transkriptionsprodukte von Mut17 und seinen ursprünglichen Varianten (Mut14, Mut11 und Mut7). Wie in Abbildung 5wiesen alle vier Varianten im Vergleich zum Wildtyp eine signifikante Reduktion der dsRNA-Produktion während der Transkription auf. Bemerkenswerterweise wies Mut17 einen deutlich geringeren dsRNA-Gehalt von nur 1,80 % und nur 0,007 ng/μg im Lösungsmittelsystem des Screenings auf.

Abbildung 5. dsRNA-Gehalt von Mut17 und seinen elterlichen Mutationen

Die Immunogenität des IVT-Produktes der Mutante ist deutlich geringer als die des Wildtyps.

Nächste, Wir untersuchten die Immunogenität der IVT-Produkte bei muriner RAW264.7 Zellen. Wie in den Abbildungen 2A und 2B gezeigt, waren die IFN-β-mRNA- und Proteinspiegel in RAW264.7 Zellen, die mit von Mutanten produzierter mRNA transfiziert wurden, verglichen mit dem Wildtyp. Dies deutet darauf hin, dass vom Wildtyp T7 RNAP synthetisierte mRNA die stärkste Immunreaktion hervorrief, während die mRNA der Mutanten eine deutlich geringere Reaktion zeigte. Insbesondere betrug die IFN-β-mRNA der mit Mut11-RNA behandelten Zellen nur 9,7 % der mit Wildtyp behandelten Zellen, und ihr Proteingehalt betrug 12,93 pg/ml. Darüber hinaus zeigte die Expression von EGFP keine signifikanten Unterschiede in Quantität oder Qualität zwischen den von verschiedenen T7-RNAPs erzeugten mRNAs (Abbildung 6C), die den Anforderungen für industrielle Anwendungen gerecht werden.

Abbildung 6. IFN-β-Reaktion und EGFP-Expression in Säugetierzellen

Die RDRP- und Terminaltransferase-Aktivitäten des Mutanten sind viel loWirr als die des Wildtyps.

Um die Auswirkungen von Mutationen auf die Reduzierung von dsRNA zu untersuchen, Zu all diesen Mutationen wurden In-silico-Studien durchgeführt. Das Ergebnis deutet eindeutig auf eine reduzierte RDRP-Aktivität in den Varianten hin, da sie eine geringere Tendenz zeigen, RNA als Vorlage zu verwenden. In ähnlicher Weise könnte dies Auswirkungen auf die terminale Transferaseaktivität von T7-RNAP gehabt haben. Wie in Figur 7, unter verschiedenen Konzentrationen zeigten alle 4 Varianten weniger als 50 % des Fluoreszenzwerts im Vergleich zum Wildtyp.

Anschließend wurde ein 3'-Ende-Heterogenitätstest durchgeführt, um die terminale Transferaktivität von T7-RNAP zu charakterisieren. Bei der Konzentration auf den Anteil der RNA mit n>0, der die terminale Transferaseaktivität widerspiegelt, fanden heraus, dass diese RNAs 82,94 % im Wildtyp ausmachten, während die Mutanten die folgenden Prozentsätze aufwiesen: Mut11 (70,29 %), Mut7 (67,88 %), Mut14 (63,31 %) und Mut17 (55,62 %) (Figur 8). Wichtig ist, dass diese Prozentsätze in hohem Maße mit der Häufigkeit von dsRNA in den Produkten übereinstimmen. (Abbildung 5)Diese Ergebnisse weisen auf eine signifikante Verringerung der terminalen Transferaseaktivität der Mutanten hin, die zusammen mit der Abnahme der RDRP-Aktivität zur Abnahme der dsRNA beiträgt.Insbesondere die terminale Transferaseaktivität könnte eine entscheidendere Rolle spielen, wie die geringste Ansammlung von n>0 RNAs in Mut17 zeigt, das auch die geringste dsRNA-Produktion aufweist. (Abbildung 5 und Abbildung 8).

Figur 7Relative RDRP-Aktivität

Figur 8Heterogenität am 3'-Ende von RNA-Produkten

Abschluss

Diese Studie liefert eine robuste Methode zur Identifizierung von Mutanten mit reduziertem dsRNA-Gehalt und isoliert erfolgreich mehrere dsRNA-Mutanten, die eine reduzierte RNA-abhängige RNA-Polymerase- und Terminaltransferase-Aktivität aufweisen. Sie stärkt die Validierung der Sicherheit und Wirksamkeit von mRNA-Therapeutika erheblich und unterstreicht ihre tiefgreifenden Auswirkungen auf die Weiterentwicklung von mRNA-Impfstoffen und Gentherapieanwendungen.

Zur gleichen Zeit hat die Muttergesellschaft Yeasen hat auch ein T7 RNAP-Produkt auf den Markt gebracht, das dsRNA deutlich reduziert Inhalt. Mehrere Partner haben bereits die von Molefuture entwickelten modifizierten T7-RNAP-Mutanten getestet und das Produkt wurde von den Kunden sehr geschätzt. Unsere Kunden glauben, dass die Verwendung des neuen Enzyms den Reinigungsprozess von mRNA vereinfacht und reduziert die Immunogenität von IVT erheblich Produkte, demonstrieren herausragende Leistung in zahlreichen Anwendungsszenarien und beweisen ihr breites Anwendungspotenzial im Bereich der Biopharmazie!

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Nachfolgend sind repräsentative Produkte von Yeasen aufgeführt. Weitere Größen sind verfügbar. Unsere Produkte sind optimal aufeinander abgestimmt, um eine überragende Leistung und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Wir können auch kundenspezifische Dienstleistungen anbieten. Wenn Sie an einem Produkt interessiert sind, das nicht gezeigt wird, kontaktieren Sie uns und wir werden mit Ihnen zusammenarbeiten, um Ihre Anforderungen zu erfüllen.