Umfassender Leitfaden für den organischen Anbau

– Ein umfassender Artikel, um Ihr Verständnis von Organoiden zu vertiefen.

Einführung in Organoide

Organoide sind dreidimensionale Strukturen mit physiologischen Funktionen, die den normalen (oder erkrankten) Zustand innerer Organe oder Gewebe nachahmen und durch 3D-Kultivierung außerhalb des Körpers erreicht werden. Einfacher ausgedrückt sind Organoide dreidimensionale Zellkulturen, in denen Stammzellen in einem Matrixgel kultiviert werden. Unter dem Einfluss chemischer Inhibitoren/Aktivatoren, Zytokine und Kulturzusätze entwickeln sich Organoide zu Gewebestrukturen, die entsprechenden Organen ähneln.

Eigenschaften von Organoiden

Organoide besitzen die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und bewahren so die physiologische Struktur und Funktion des Ausgangsgewebes. Sie werden oft als „Mikroorgane in einer Schale“ bezeichnet. Durch die Nutzung der Fähigkeiten von Stammzellen zur Selbsterneuerung, Differenzierung und Selbstorganisation können Organoide für die Verwendung in Biobanken kryokonserviert und unbegrenzt vermehrungsfähig gemacht werden. Organoide sind hochkomplex und ähneln im Vergleich zu 2D-Zellen eher dem Zustand in vivo.

Abbildung 1. Organoid-Kultivierung von menschlichen Kolonadenokarzinomzellen [1]

Anwendungen von Organoiden

Das Besondere an Organoiden ist ihre Fähigkeit, die In-vivo-Umgebung besser zu simulieren, wodurch sie sich für molekular- und zellbiologische Analysen eignen. Organoide schließen die Lücke zwischen Tier- und Zellebene und bieten eine hervorragende Lösung für die Forschung in Bereichen wie Tumorforschung, Arzneimittelscreening, regenerative Medizin und mehr. Sie werden häufig bei der funktionellen Gewebeinduktion, der Etablierung von Krankheitsmodellen, dem Arzneimittelscreening, entzündungshemmenden Tests, der klinischen Forschung und verschiedenen anderen Forschungsaspekten eingesetzt und zeigen sowohl in der Grundlagenforschung als auch in translationalen Anwendungen großes Potenzial.

Im Zuge der Weiterentwicklung von Organoid-Kultivierungssystemen und experimentellen Techniken werden Organoide für zahlreiche Gewebe und Organe eingesetzt, darunter Darm (Dünndarm/Dickdarm), Magen, Leber, Herz, Lunge, Prostata, Bauchspeicheldrüse, Nieren, Brust, gehirnähnliche Strukturen, Netzhaut, Innenohr und mehr.

Aus Tumorstammzellen gewonnene Organoide haben großes Potenzial für das Verständnis der Mechanismen der Tumorentstehung und -entwicklung, das Screening der Arzneimittelempfindlichkeit sowie die Förderung der Präzisionsmedizin und der personalisierten Diagnose gezeigt. Mehrere Artikel in Cell und Science weisen darauf hin, dass Organoide eine hohe Sensitivität und Spezifität bei der Vorhersage der Wirksamkeit von Krebsmedikamenten aufweisen. In jüngster Zeit haben Tumor-Organoide ihre Rolle bei der Vorhersage der Patientenreaktion auf Krebsmedikamente und bei der Formulierung personalisierter Behandlungspläne unter Beweis gestellt.

Erforschung von Entwicklungsmechanismen: Aufgrund ihrer Differenzierungsfähigkeit eignen sich Organoide für die Untersuchung embryonaler Entwicklungsprozesse und -mechanismen. Die durch Signalwege wie Wnt und BMP regulierten Induktionsprozesse können zur Untersuchung der Entwicklung von Organen wie Gehirn, Bauchspeicheldrüse und Magen verwendet werden [2][3][4].

Erstellung von Krankheitsschädigungsmodellen: Aus bestimmten Geweben oder Organen induzierte Organoide können zur Untersuchung von Modellen bestimmter Krankheiten verwendet werden. Die von Zhao Bing und Lin Xinhua geleiteten Teams verwendeten menschliche Organoid-Infektionsmodelle, um die molekularen Mechanismen einer SARS-CoV-2-Infektion und von Leberschäden zu untersuchen, und stellten damit wichtige Instrumente für die Erforschung der pathogenen Mechanismen des Virus und die anschließende Arzneimittelentwicklung bereit [5]. Die von Deng Hongkui an der School of Life Sciences der Peking University geleitete Forschungsgruppe verwendete kleine Moleküle und Zytokine, um die Konstruktion eines neuartigen Darmorganoids mit Merkmalen der Schadensregeneration anzuregen – Hyper Organoid.Dieses Organoid kann über einen längeren Zeitraum passagiert und amplifiziert werden, wodurch das Genom erhalten bleibt, die Reparatur von Schäden im Dickdarmgewebe gefördert, die pathologischen Symptome in einem Tiermodell für akute Colitis gelindert werden und vieles mehr [6].

Regenerative Medizin: Aus Stammzellen gewonnene Organoide können beschädigtes oder erkranktes Gewebe reparieren oder ersetzen, um die normale Gewebefunktion wiederherzustellen. Sie finden in der Zelltherapie breite Anwendung, unter anderem bei anderen neurodegenerativen Erkrankungen, Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Netzhauterkrankungen, Rückenmarksverletzungen und mehr. Als neuartige Behandlung im Bereich der regenerativen Medizin stimuliert DA01, das kleine Moleküle wie SB-431542, LDN193189, CHIR-99021, Y-27632 und das Sonic Hedgehog (Shh)-Protein verwendet, pluripotente Stammzellen zur Differenzierung in dopaminerge Neuronen. Diese Neuronen werden dann in die verletzten Bereiche des Gehirns von Patienten mit Parkinson im Spätstadium transplantiert, was eine neue Richtung und Herangehensweise für die Behandlung der Krankheit bietet [7].

Prüfung der Arzneimitteltoxizität und -wirksamkeit: Organoide können verwendet werden, um die Pharmakotoxizität neuer Arzneimittel in bestimmten Organen oder Geweben zu überprüfen und so Daten für die Entwicklung neuer Arzneimittel bereitzustellen. Ein Beispiel hierfür ist die Verwendung von Hyman-Nierenorganoiden zur Überprüfung der Nierentoxizität von Cisplatin [8].

Arzneimittelscreening: Aus Stammzellen gewonnene Organoide können für In-vitro-Tests von Arzneimittelreaktionen verwendet werden und bieten theoretische Unterstützung für das Arzneimittelscreening. Dickdarm-Organoide können verwendet werden, um Medikationspläne für Patienten mit CFTR-Mutationen zu untersuchen, und Tumor-Organoide können verwendet werden, um individuelle Medikationssituationen für Patienten zu beurteilen [9].

Entwicklungsgeschichte der Organoide

Quellen von Organoiden

Normale Organoide stammen hauptsächlich aus Stammzellen, darunter pluripotente Stammzellen (PSCs) und adulte Stammzellen (ASCs). Zu den pluripotenten Stammzellen zählen embryonale Stammzellen (ESCs) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs). Im Vergleich zu pluripotenten Stammzellen haben adulte Stammzellen den Vorteil, dass sie einfacher und schneller zu modellieren sind, aber den Nachteil, dass sie relativ einfachere Organoidstrukturen konstruieren. Aus pluripotenten Stammzellen konstruierte Organoidstrukturen sind komplexer.

Produkte in Organoide-Kultivierung

Häufig verwendete kleine Moleküle in der Organoidkultur (Zusammenfassung): Super praktisch, Lesezeichen nicht vergessen!

❶ Y-27632 (Kat.-Nr. 53006ES, Kat.-Nr. 52604ES): Ein starker Inhibitor von Rock, der p160ROCK (Ki = 140 nM) und ROCK-II (IC50 = 800 nM) durch ATP-Konkurrenz kompetitiv hemmt.Es hemmt auch PRK2 (IC50 = 600 nM). Wird normalerweise bei der ersten Aussaat in der Plattenkultur zugegeben; bei späteren Mediumwechseln ist möglicherweise keine Zugabe erforderlich. Die Behandlung menschlicher embryonaler Stammzellen mit Y-27632 (10 µM) für 1 Stunde kann die Apoptose hemmen, die Klonleistung steigern und die Zellpassagen verlängern.

Empfohlene Arbeitskonzentration: 10 μM

❷ SB-202190 (Kat.-Nr. 53005ES): Ein effizienter p38-MAPK-Kinase-Inhibitor, der auf p38α/β abzielt. SB202190 kann die Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen in Herzmuskelzellen induzieren, die Selbsterneuerung neuraler Stammzellen fördern und ist für die Kultur von Magen-Darm- und Brustdrüsen-Organoiden anwendbar.

Empfohlene Lösungskonzentration: Lösen Sie 10 mg in 3,018 ml DMSO, um eine 10 mM-Lösung zu erhalten; lagern Sie sie bei -20 °C.

Empfohlene Arbeitskonzentration: 10 μM

❸ CHIR-99021 (Kat.-Nr. 53003ES): Ein Aminopyrimidin-Derivat, das als GSK-3-Inhibitor (GSK3α/β) wirkt. Es induziert die Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen ins Endoderm und wird in Nieren- und Netzhautorganoidkulturen verwendet. CHIR-99021 stimuliert in Kombination mit anderen Reagenzien die Umprogrammierung somatischer Zellen in Stammzellen.

Empfohlene Lösungskonzentration: 5 mg in 3,58 ml DMSO auflösen, um eine 3 mM-Lösung zu erhalten; bei -20 °C lagern.

Empfohlene Arbeitskonzentration: 3 μM

❹ A 83-01 (Kat.-Nr. 53002ES): Ein Inhibitor des Activin/NODAL/TGF-β-Signalwegs, der die ALK5/4/7-Kinaseaktivität hemmt. Wird im Allgemeinen in der Kultur von Leber-, Prostata- und Brustdrüsenorganoiden verwendet. Es wird häufig verwendet, um die Differenzierung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) zu hemmen und die Selbsterneuerung von Zellen in vitro aufrechtzuerhalten.

Empfohlene Lösungskonzentration: Lösen Sie 5 mg in 5,93 ml DMSO auf, um eine 2 mM-Lösung zu erhalten; lagern Sie sie bei -20 °C. (Hinweis: Dieses Produkt ist in Lösung instabil und wird für die sofortige Verwendung nach der Zubereitung empfohlen.)

Empfohlene Arbeitskonzentration: 2 μM

❺ Gastrin I (Kat.-Nr. 53007ES): Gastrin ist ein endogenes gastrointestinales Peptidhormon, das die Magenwandzellen zur Sekretion von Magensäure anregt. Es ist für Studien an gastrointestinalen Organoiden von entscheidender Bedeutung. Bei der Kultivierung von Darm- und Leberorganoiden hilft die Zugabe von Gastrin, die Überlebenszeit der Organoide zu verlängern.

Empfohlene Lösungskonzentration: Lösen Sie 1 mg in 2,38 ml 1%iger Ammoniaklösung auf, um eine 0,2 mM-Lösung zu erhalten; lagern Sie sie bei -20 °C.

Empfohlene Arbeitskonzentration: 10 nM

❻ Nicotinamid (Kat.-Nr. 51402ES): Nicotinamid, ein Vitamin B3, ist an verschiedenen enzymatischen Redoxreaktionen beteiligt und wird bei der Kultur von Organoiden des Magen-Darm-Trakts, der Leber und der Brustdrüsen verwendet. Nicotinamid weist in Verbindung mit Zytokinen und anderen biochemischen Reagenzien entzündungshemmende Eigenschaften auf, fördert die Differenzierung mesenchymaler Stammzellen in insulinproduzierende Zellen, hemmt die Sirtuinaktivität und wird verwendet, um die Organoidbildung zu fördern und die Lebensdauer von Organoiden zu verlängern.

Empfohlene Lösungskonzentration: Lösen Sie 100 mg in 8,19 ml H2O (oder DMSO), um eine 100 mM-Lösung zu erhalten; lagern Sie sie bei -20 °C.

Empfohlene Arbeitskonzentration: 10 mM

❼ Forskolin (Kat.-Nr. 51001ES): Forskolin kann Adenylatcyclase aktivieren, die häufig verwendet wird, um intrazelluläre cAMP-Werte zu erhöhen. Forskolin induziert die Differenzierung verschiedener Zelltypen, aktiviert PXR und FXR und hat eine Thrombozytenaggregationshemmung und blutdrucksenkende Wirkung. Bei der Kultivierung von Leberorganoiden ist die Zugabe dieser Substanz unerlässlich.

Empfohlene Arbeitskonzentration: 1-10 μM

❽ Prostaglandin E2 (Kat.-Nr. 60810ES): Prostaglandin E2 (PGE2) reguliert viele physiologische Systeme und vermittelt Zellproliferation und -differenzierung.Es wird bei der Kultivierung von Leber- und Prostata-Organoiden benötigt und steht im Zusammenhang mit der Entspannung der glatten Muskulatur, Entzündungen, Fortpflanzung, der Regulierung des Schlafzyklus und der Integrität der Magenschleimhaut.

Empfohlene Lösungskonzentration: Lösen Sie 1 mg in 0,28 ml DMSO, um eine 10 mM-Lösung zu erhalten; lagern Sie sie bei -20 °C.

Empfohlene Arbeitskonzentration: 500 nM

❾ N-Acetyl-L-Cystein (Kat.-Nr. 50303ES): N-Acetyl-L-Cystein (NAC) ist ein Vorläufer des Antioxidans Glutathion mit antioxidativer und ROS-hemmender Wirkung. Es hemmt die Apoptose neuronaler Zellen und wird im Kulturprozess der meisten Organoide benötigt.

Empfohlene Lösungskonzentration: 2 g in 24,51 ml H2O (oder DMSO) auflösen, um eine 500 mM-Lösung zu erhalten; bei -20 °C lagern.

Empfohlene Arbeitskonzentration: 1 mM

Verwandte Produktinformationen

Verweise:

[1] Sato T, Stange DE, et al.Langfristige Expansion von Epithel-Organoiden aus menschlichem Dickdarm, Adenom, Adenokarzinom und Barrett-Epithel. Gastroenterologie. 2011 Nov;141(5):1762-72. doi: 10.1053/j.gastro.2011.07.050. Epub 2011 Sep 2. PMID: 21889923.

[2] Lancaster MA, Renner M, et al. Zerebrale Organoide modellieren die menschliche Gehirnentwicklung und Mikrozephalie. Nature. 2013.501(7467):373-379. http://dx.doi.org/10.1038/nature12517.

[3] Greggio C, et al. Künstliche dreidimensionale Nischen dekonstruieren die Pankreasentwicklung in vitro. Entwicklung. 2013.140(21):4452-4462. http://dx.doi.org/10.1242/dev.096628.

[4] McCracken KW, et al. Modellierung der menschlichen Entwicklung und Krankheit in aus pluripotenten Stammzellen gewonnenen Magen-Organoiden. Nature. 2014.516(7531):400-404. http://dx.doi.org/10.1038/nature13863.

[5] Zhao B, Ni C, et al. Rekapitulation einer SARS-CoV-2-Infektion und Cholangiozytenschädigung mit menschlichen Lebergangorganoiden. Protein Cell. 2020 Okt;11(10):771-775. doi: 10.1007/s13238-020-00718-6. PMID: 32303993; PMCID: PMC7164704.

[6] Qu M, Xiong L, et al. Aufbau von intestinalen Organoidkulturen zur Modellierung der verletzungsbedingten Epithelregeneration. Cell Res. 2021 März;31(3):259-271. doi: 10.1038/s41422-020-00453-x. Epub 2021 Jan 8. PMID: 33420425; PMCID: PMC8027647.

[7] BlueRock Therapeutics gibt die erste mit DA01 dosierte Patientin in Phase-1-Studie an Patienten mit fortgeschrittener Parkinson-Krankheit bekannt. Pressemitteilung von BlueRock Therapeutics: 8. Juni 2021.

[8] Takasato M, Er PX, et al. Nieren-Organoide aus menschlichen iPS-Zellen enthalten mehrere Linien und modellieren die menschliche Nephrogenese. Nature. 2015.526(7574):564-568. http://dx.doi.org/10.1038/nature15695.

[9] Spence JR, Mayhew CN, et al. Gerichtete Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen in Darmgewebe in vitro. 2011.470(7332):105-109. http://dx.doi.org/10.1038/nature09691.