Quick T4 DNA Ligase ist ein Einzelenzymprodukt, das zur Ligation von DNA-Fragmenten und Adaptern im Prozess der NGS-Bibliothekskonstruktion verwendet werden kann. Dieses Produkt wurde durch Hochdurchsatzsequenzierung verifiziert und weist eine hervorragende Qualität auf. Kunden, die keine experimentelle Systemanpassung benötigen, wird empfohlen, das Hieff NGSTM Fast-Pace DNA Ligation Module (Kat.-Nr. 12607) zu erwerben.

Produktkomponenten

Versand und Lagerung

Das Produkt wird mit Kühlakkus versendet und ist bei -20°C zwei Jahre lagerfähig.

Einheitendefinition

In einem 20 μL-Ligationsreaktionssystem wird die für eine über 50 %ige Ligation der DNA-Fragmente erforderliche Enzymmenge als eine Einheit (U) definiert, wenn 6 μg λDNA-Hind Ⅲ 30 Minuten lang bei 16 °C reagieren gelassen werden.

Vorsichtsmaßnahmen

1. Wenn beim Schmelzen des Puffers eine kleine Menge Niederschlag auftritt, drehen Sie ihn bitte um und mischen Sie ihn vor der Verwendung gut durch.

2. Tragen Sie zu Ihrer Sicherheit und Gesundheit bei Operationen bitte Laborkittel und Einweghandschuhe.

3. Dieses Produkt ist NUR für Forschungszwecke bestimmt!

Anweisungen

1. Die derzeit gängigen DNA-Bibliotheksbaukästen werden nach der Endreparatur und der A-Tailing-Behandlung im Allgemeinen nicht gereinigt und führen direkt eine Adapterligation durch. Bitte beachten Sie die folgende Vorbereitung für das Reaktionssystem. Gründlich vortexen, kurz zentrifugieren und 15 Minuten bei 20 °C inkubieren.

[Hinweis]: *50 % PEG 6000 sind nicht im Kit enthalten, Sie müssen es selbst zubereiten.

**Die Anzahl der Adapter finden Sie in der folgenden Tabelle.

***Die Menge der verwendeten Quick T4 DNA Ligase kann je nach Bedarf um 1–5 μL erhöht werden.

2. Die Qualität und Konzentration der verwendeten Adapter wirken sich direkt auf die Ligationseffizienz und die Bibliotheksausbeute aus. Zu viel Adaptergebrauch kann zu mehr Adapterdimeren führen, während ein geringerer Gebrauch die Ligationseffizienz und die Bibliotheksausbeute beeinträchtigen kann. In der folgenden Tabelle ist die empfohlene Menge an Adaptern aufgeführt, die in verschiedenen Input-DNA-Situationen mit diesem Kit verwendet werden.

[Hinweis]: Eingabe-DNA-Mol (pmol) ≈ Eingabe-DNA (ng) / [0,66 × Eingabe-DNA-Durchschnittslänge (bp)].

Berechnungsbeispiel für die Adapterligation: Wie viel Adapter sollte hinzugefügt werden, wenn die Eingangs-DNA 100 ng und die Länge 300 bp beträgt?

Schritt 1: Berechnen Sie die Anzahl der Mol der eingegebenen DNA. Formel: Mol der eingegebenen DNA (pmol) ≈ Mol der eingegebenen DNA (ng) / [0,66 × durchschnittliche Länge der eingegebenen DNA (bp)]; Mol der eingegebenen DNA (pmol) = 100 ÷ (0,66 × 300) = 0,5 pmol;

Schritt 2: Berechnen Sie anhand der obigen Tabelle die Anzahl der Mol des hinzugefügten Adapters. Bei einer Eingangs-DNA von 100 ng beträgt das Molverhältnis von Adaptern zu Eingangs-DNA 100:1 und die Anzahl der Mol des hinzugefügten Adapters beträgt 100 × 0,5 pmol = 50 pmol.

Schritt 3: Berechnen Sie das zugegebene Adaptervolumen. Adapterkonzentration = 15 μmol/l (wenn Sie einen Adapter eines anderen Unternehmens verwenden, müssen Sie seine Konzentration gemäß dessen Anweisungen bestimmen); zugegebenes Adaptervolumen = zugegebene Mol Adapter (50 pmol) ÷ Konzentration des Adapters (15 μmol/l) = 3,34 μl (Hinweis: 15 μmol/l = 15 pmol/μl);

Zusammenfassend beträgt das Volumen, zu dem der Adapter hinzugefügt werden kann, 3,4 μL. (Hinweis: Das maximale Zugabevolumen des Adapters überschreitet 5 μL nicht.)