Hieff^™ Fast Cell Direct Das RT-qPCR-Kit auf Basis des Farbstoffs SYBR Green eignet sich für die RNA-Extraktion aus allen Arten tierischer Zellen (wie Zellwandzellen und Suspensionszellen, Primärkulturzellen, verschiedene Stammzellen, iPS-Zellen usw.), ohne dass RNA extrahiert werden muss, und kann direkt für die qPCR-Expressionsanalyse verwendet werden, die kurz, einfach zu handhaben und fehlerarm ist. Die Schritte von der Vorlagenvorbereitung bis zur Reverse-Transkriptionsreaktion und Genexpressionsanalyse dauern nur 1,5 Stunden.

Im Kit sind Reagenzien für die Reverse Transkription und Fluoreszenzerkennung enthalten, die für die Genexpressionsanalyse verwendet werden können, ohne dass zusätzliche Reagenzien gekauft werden müssen.

Technische Daten

Komponenten

Lagerung

FCD-Lyse-Puffer und FCD-Waschpuffer wurden geschmolzen und bei 4 °C gelagert, um eine Kontamination zu verhindern. FCD-Stopplösung, DNase I, 4× Hifair™ FCD RT-Mix, 2× Hieff™ FCD qPCR SYBR Master Mix sollten bei -25–15 °C gelagert werden.

Anweisungen

1. Herstellung von Spaltprodukten

1)1. Das Reagenz bei Raumtemperatur schmelzen, vor Gebrauch umdrehen und vorsichtig mischen. Nach leichtem Zentrifugieren verwenden, um Schaumbildung zu vermeiden*.

*Wenn die Reagenzien nicht gemischt werden, kein Oszillator zum Mischen verwendet wird oder die Reagenzien nicht auf Eis konfiguriert werden, kann dies zu einer Leistungsminderung der Reaktion führen.

2) Je nach Zelltyp** werden die Zellen in ein Zentrifugenröhrchen gegeben und 2 Minuten lang bei 5000 U/min zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln und das Medium gut abzusaugen. Wenn die Zellen in 96-Well-Platten kultiviert werden, kann das Medium direkt abgesaugt werden.

​​​​​​​3) Geben Sie 150 μL FCD-Waschpuffer in jede Vertiefung, waschen Sie die Zellen durch Ausblasen, zentrifugieren Sie sie 2 Minuten lang bei 5000 U/min und saugen Sie den FCD-Waschpuffer ab***.

​​​​​​​4) Geben Sie 48 μl FCD-Lyse-Pufferlösung und 2 μl DNase Ⅰ-Lösung in jede Vertiefung, blasen Sie alles aus und mischen Sie es bei Raumtemperatur, lassen Sie es dann 5 Minuten stehen und geben Sie dann 2 hinzu.5 μL FCD-Stopplösung nach der Inkubation****, und dann etwa 5-mal blasen und mischen, um das Spaltprodukt***** zu erhalten.

** Die Grundanforderung an die Anzahl der Zellen beträgt 1 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung, und dieses Kit kann im Bereich von 1 × 10 verwendet werden³ 1 × 10⁶ Zellen. Wenn die Anzahl der Zellen größer ist, kann die Menge der FCD-Lyse-Pufferlösung und der DNase-Lösung entsprechend proportional erhöht werden.

*** Die Zentrifugationsbedingungen sind von Zelle zu Zelle unterschiedlich. Zentrifugieren Sie daher bitte mit einer für die verwendeten Zellen geeigneten Geschwindigkeit.

**** Fügen Sie 2,5 μl FCD-Stopplösung zu 50 μl Lysat hinzu und erhöhen Sie die Menge der FCD-Stopplösung nach Bedarf.

***** Zur Langzeitlagerung von Zelllyseproduktlösungen sollten diese bei -20 °C gelagert werden.

5）4 x Hifair™ FCD RT Mix bei Raumtemperatur schmelzen und unter leichtem Umdrehen mischen, auf Eis legen und das Reaktionssystem gemäß der folgenden Tabelle konfigurieren:

*******Die empfohlene Verwendungsmenge beträgt 2–5 μl. Versuchen Sie, 45 % nicht zu überschreiten.

1. Umgekehrte Transkription

Pipettieren und mischen Sie die oben vorbereitete Reaktionslösung vorsichtig und führen Sie die Reverse-Transkriptionsreaktion gemäß dem Verfahren in der folgenden Tabelle durch:

* Die empfohlene Temperatur für die Reverse Transkription beträgt 55 °C. Bei Vorlagen mit hohem GC-Gehalt oder komplexen Vorlagen kann die Temperatur für die Reverse Transkription auf 60 °C erhöht werden. Das Reverse-Transkriptionsprodukt kann direkt für die nachfolgende RT-qPCR-Erkennung verwendet werden. Um die Hemmung der qPCR-Reaktion durch das Reverse-Transkriptionssystem zu vermeiden und den entsprechenden Ct-Wert (10-35) zu erhalten, kann das Produkt 10-1000-fach verdünnt und dann verwendet werden. Wenn nachgelagerte Experimente für kurze Zeit nicht durchgeführt werden, Es kann zur Lagerung bei -20 °C gelagert werden.

1. Quantitative Fluoreszenz-PCR

1) Reaktion System Konfiguration

Für die Herstellung der Reaktionslösung werden folgende Verhältnisse empfohlen (Herstellung auf Eis).

*Fügen Sie nicht mehr als 1/10 des RT-qPCR-Volumens des Reverse-Transkriptionsprodukts hinzu. Eine hohe Konzentration der Vorlage führt leicht zu einer unspezifischen Amplifikation, eine geeignete Verdünnung ist 5- bis 50-fach. Die empfohlene Vorlagenmenge beträgt 4 μl, versuchen Sie, 6 μl nicht zu überschreiten. Bei schlechter Reaktionsleistung kann die Primerkonzentration im Bereich von 0,2-1,0 μmol/l angepasst werden.

2）Fluoreszenz-quantitatives PCR-Amplifikationsverfahren (Zwei-Schritt-Methode)

3）Schnelles Amplifikationsverfahren für die fluoreszierende quantitative PCR (Zwei-Schritt-Methode)

* Die Annealing-/Extensionstemperatur und die endgültige Extensionszeit können entsprechend den experimentellen Anforderungen angepasst werden. Das Schnellprogramm ist für die meisten Gene geeignet, und das Standardprogramm kann für einzelne komplexe Sekundärstrukturgene ausprobiert werden.

Hinweise

1. Dieses Produkt ist nur für Forschungszwecke bestimmt.
2. Bitte arbeiten Sie zu Ihrer Sicherheit mit Laborkitteln und Einweghandschuhen.

Ver.EN20230908

Unterlagen:

Benutzerhandbücher

11172-Hieff™ Fast Cell Direct. EN20230908.pdf