Das Hieff Superfast DNA Methylation Bisulfite Kit (säulenbasiert) wandelt unmethylierte Cytosine in DNA-Proben schnell in Uracil um, während methylierte Cytosine unverändert bleiben. Während der Hochtemperatur-Bisulfitbehandlung denaturiert doppelsträngige DNA zu Einzelsträngen. In Gegenwart von HSO3- werden Cytosinreste desaminiert und in Uracil umgewandelt, wobei methylierte Cytosine unverändert bleiben. Bei der anschließenden PCR-Amplifikation wird Uracil durch Thymin (T) ersetzt. Der Umwandlungsprozess dauert nur 5 Minuten, ermöglicht DNA-Eingaben von 100 pg bis 2 μg und erreicht eine Umwandlungseffizienz von ≥99 % für unmethylierte Cytosine. Die umgewandelte DNA eignet sich für nachgelagerte Anwendungen wie PCR-Amplifikation und NGS-Sequenzierung.

Besonderheit

Niedriger Eingang: Geeignet für die Konvertierung von Proben im Bereich von 100 pg bis 2 μg

Kurze Umbauzeit: ca. 5 Minuten.

Minimale Probenbeschädigung: Aufrechterhaltung einer guten Probenintegrität nach der Konvertierung.

Hohe Umwandlungseffizienz: Konversionsrate ≥99%, hohe Konversionsraten in High-GC-Regionen mit einer niedrigen Rate an falsch-positiven Ergebnissen.

Geeignet für seltene Proben, wie etwa die Umwandlung der DNA-Methylierung in einzelnen Zellen.

Kann RNA-Proben durch Methylierung umwandeln.

Produkt Komponenten

Notiz:

Für 10 Tests pro Schachtel: Fügen Sie der Waschlösung 4,4 ml wasserfreies Ethanol hinzu.

Für 50 Tests pro Schachtel: Fügen Sie der Waschlösung 22 ml wasserfreies Ethanol hinzu.

Nach Zugabe des wasserfreien Ethanols umdrehen und gut mischen, dann für die spätere Verwendung aufbewahren. Stellen Sie sicher, dass der Flaschendeckel fest verschlossen ist, um eine Verdunstung des Ethanols zu verhindern, die die Leistung des Reagenzes beeinträchtigen könnte.

Figur

Abbildung 4. Die Bisulfit-Konvertierung menschlicher genomischer DNA-Proben wurde mit den Konvertierungskits 12225 und Q des Mitbewerbers durchgeführt. Anschließend wurden methylierungsspezifische Kits zur Herstellung einzelsträngiger DNA-Bibliotheken verwendet, um Bibliotheken zu erstellen. Die Bibliotheksausbeute und die Qualitätskontrolldaten sind oben dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass bei der Sequenzierung der gepoolten Bibliotheken sowohl mit dem 12225-Kit als auch mit dem Q des Mitbewerbers das 12225-Kit eine höhere Datenausbeute lieferte, eine höhere Zielgenauigkeit (%) erreichte und niedrigere Duplikationsraten (%) aufwies.

Versand und Lagerung

Lagern Sie die Konversionslösung 12225-A bei Raumtemperatur und lichtgeschützt. Lagern Sie die anderen Komponenten bei Raumtemperatur. Die Haltbarkeit beträgt 12 Monate.

Notiz:

1. Um den Erfolg nachfolgender Experimente sicherzustellen, quantifizieren Sie die Gesamtmenge der eingegebenen DNA während des Konvertierungsschritts genau. Es wird empfohlen, Qubit 3.0/4.0 zur DNA-Quantifizierung mit einem A260/A280-Verhältnis zwischen 1,7 und 1,9 zu verwenden. Der Bereich der eingegebenen DNA sollte zwischen 100 pg und 2 μg liegen, wobei der optimale Bereich zwischen 100 ng und 1 μg liegt. Unzureichende DNA-Zufuhr kann die nachfolgende Erkennung behindern, während übermäßige Zufuhr die Rückgewinnung und Konvertierungseffizienz verringern kann.

2. Die Konversionslösung, Desulfonierungslösung und Waschlösung enthalten flüchtige Bestandteile. Nach Gebrauch sofort die Kappen festziehen und bei Raumtemperatur lagern.

3. Führen Sie bei Proben nach der Umwandlung umgehend weitere Experimente durch. Bewahren Sie die Proben bei kurzfristiger Lagerung bei -20 °C und bei langfristiger Lagerung bei -80 °C auf.

4. Tragen Sie zu Ihrer Sicherheit und Gesundheit während des Betriebs einen Laborkittel und Einweghandschuhe.

5. Dieses Produkt ist nur für Forschungszwecke bestimmt!

Anweisungen

Vorbereitung von Reagenzien und Verbrauchsmaterialien: 1,5 ml steriles Zentrifugenröhrchen, enzymfreies Wasser, absoluter Ethanol, PCR-Röhrchen;

m Bisulfit-Umwandlung:

1) Bereiten Sie entsprechend der Anzahl der zu testenden Proben das entsprechende sterile PCR-Röhrchen vor und bereiten Sie das Reaktionssystem gemäß der folgenden Tabelle vor:

2) Transformationssystem

Blasen und mischen Sie das obige System mit einer Pipette oder wirbeln Sie es 5 s lang und mischen Sie es, zentrifugieren Sie es dann kurz und zentrifugieren Sie die Reaktionslösung auf den Boden des PCR-Röhrchens.

gegen Hinweis: 1. Zu diesem Zeitpunkt beträgt das Gesamtvolumen der Reaktionslösung im PCR-Röhrchen 200 μL. Um die Transformation vollständiger zu machen, sollte die Reaktionslösung in gleiche Teile geteilt und nach dem Blasen und Mischen in Schritt 2) in ein neues steriles PCR-Röhrchen überführt und das Transformationsverfahren ausgeführt werden. Nach der Umwandlung wurden die Reaktionslösungen in den beiden PCR-Röhrchen zur Reinigung in derselben Reinigungssäule kombiniert.

2. Wenn das Probenvolumen zwischen 20 und 40 μl liegt, reduzieren Sie das Volumen der Transformationslösung, um ein Gesamtvolumen von 200 μl beizubehalten.

3. Wenn das Probenvolumen 50 μL beträgt, werden 150 μL der Transformationslösung hinzugefügt, das Gesamtvolumen bei 200 μL gehalten und die Transformationszeit auf 6–10 Minuten verlängert.

3) Einstellung des CT-Konvertierungsprogramms

Das PCR-Röhrchen wird auf ein PCR-Gerät mit einem voreingestellten Programm gesetzt, um die Reaktion durchzuführen.

m Reinigung

1) TÜbertragen Sie 200 μL der Konvertierung Lösung für die PVeredelungssäuleS, 30-60 s zentrifugieren 13000 G, das Filtrat verwerfen und die Reinigungssäule in den CSammelröhrchenS wieder;

2) Fügen Sie 100 μL Waschpuffer hinein Reinigungssäulen (bestätigen, dass absoluter Ethanol hinzugefügt wurde), 30-60 s zentrifugieren 13000 G, das Filtrat verwerfen und die Reinigungssäule in den CSammelröhrchenS wieder;

3) Fügen Sie 200 μL Desulfonierungspuffer in die Reinigungssäulen , und lassen Sie die Reaktion 20 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Nach der Reaktion 30-60 s zentrifugieren 13000 G, das Filtrat verwerfen und die Reinigungssäulen im CSammelröhrchenS wieder;

4) Fügen Sie 200 μL der Waschpuffer zur Reinigungssäulen, 30-60 s zentrifugieren 13000 G Das Filtrat entsorgen und die PVeredelungssäuleS im CSammelröhrchenS wieder;

5) Wiederholen Sie Schritt 4) einmal;

6) Übertragen Sie die Reinigungssäulen zu dem vorbereiteten 1,5 mL Zentrifugenröhrchen 10-30 μL Elutionspuffer zur Mitte der Filtermembran nach dem Öffnen der Abdeckung und Trocknen, und sammeln Sie die DNA nach 1 min Stehenlassen bei Raumtemperatur und 1 min Zentrifugieren bei 13000 G;

7) Speichern Sie die DNA vorübergehend bei -20 ℃. Für die langfristige Lagerung lagern Sie bitte die DNA bei -80 ℃ und vermeiden Sie unnötiges wiederholtes Einfrieren und Auftauen.

Hinweis: Das gereinigte Transformationsprodukt kann direkt in der nachfolgenden PCR-Reaktion oder im Sequenzierungsprozess verwendet werden.

Handbuch