Produktbeschreibung

Das Hieff NGS™ mRNA Isolation Master Kit ist ein magnetisches Bead-Kit speziell für die mRNA-Reinigung. Die mRNA Capture Beads sind mikrometergroße paramagnetische Mikrokügelchen, die mit Oligo dT (Poly A)-Schwänzen gekoppelt sind und durch Bindung an mRNA mit Poly A-Schwänzen zur Isolierung von mRNA aus 10 ng bis 4 μg vollständiger RNA verwendet werden können.

Technische Daten

Komponenten

Lagerung

Das Produkt sollte ein Jahr lang bei 2 – 8 °C gelagert und ein Einfrieren vermieden werden.

Anweisungen

1. Erforderliche Materialien nicht im Lieferumfang enthalten

Magnetgestell, Nuklease-freie PCR-Röhrchen

2. Betrieb

1) Äquilibrieren der mRNA Capture Beads bei Raumtemperatur (~ 30 min).

2) Verdünnen Sie 10 ng – 4 μg Gesamt-RNA mit nukleasefreiem Wasser auf 50 μL in einem nukleasefreien PCR-Röhrchen und stellen Sie es auf Eis.

3) Mischen Sie die Magnetkügelchen, indem Sie sie umdrehen oder auf dem Vortex-Röhrchen mischen. Geben Sie 50 μL der Magnetkügelchen zu 50 μL Gesamt-RNA-Probe hinzu und pipettieren Sie 6 Mal, um gut zu mischen. Zentrifugieren Sie kurz bis zum Boden des Röhrchens.

4) Inkubieren Sie die Mischung aus magnetischen Perlen und RNA in einem Thermocycler und führen Sie das folgende Programm aus: 65 °C, 5 Min.; 25 °C, 5 Min.; 25 °C, halten.

5) Stellen Sie das Röhrchen auf einen Magneten Gestell 5 Minuten lang, um mRNA von Gesamt-RNA zu trennen. Überstand vorsichtig entfernen.

6) Entfernen Sie das Rohr vom Magneten Gestell und resuspendieren Sie die magnetischen Beads mit 200 μL Beads Wash Buffer. Pipettieren Sie das gesamte Volumen 6 Mal auf und ab, um es gründlich zu vermischen. Stellen Sie das Röhrchen auf einen magnetischen Gestell 5 Minuten stehen lassen und das Überstand vorsichtig entfernen.

7) Wiederholen Sie Schritt 6.

8) Entfernen Sie das Rohr vom Magneten Gestell. Fügen Sie 50 μl Tris-Puffer hinzu, um die magnetischen Perlen zu resuspendieren, und pipettieren Sie 6 Mal, um sie gründlich zu vermischen.

9) Geben Sie die Probe in einen Thermocycler und führen Sie das folgende Programm aus, um die mRNA zu eluieren: 80 °C, 2 Min.; 25 °C, halten.

10) Nehmen Sie die Probe aus dem Thermocycler. Geben Sie 50 μl Beads Binding Buffer hinzu und pipettieren Sie 6-mal, um alles gründlich zu vermischen.

11) 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, damit die mRNA an die magnetischen Kügelchen binden kann.

12) Platzieren Sie das Röhrchen auf dem Magneten 5 Minuten stehen lassen und das Überstand vorsichtig entfernen.

[Hinweis]: Zum Absaugen der restlichen Flüssigkeit wird eine 10-μL-Pipette benötigt.

13) Entfernen Sie das Rohr vom Magneten Gestell, resuspendieren Sie die magnetischen Beads mit 200 μL Beads Wash Buffer, pipettieren Sie 6-mal, um sie gründlich zu vermischen. Stellen Sie das Röhrchen auf die magnetische Gestell 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. Den gesamten Überstand entfernen und entsorgen.

14) mRNA-Endelution

Schema A: Für die Reserve-Transkriptionsreaktion

Entfernen Sie das Rohr vom magnetischen Gestell12 μL nukleasefreies Wasser hinzufügen und zum gründlichen Vermischen sechsmal wiederholt pipettieren. Platzieren Sie das Röhrchen im Thermocycler und führen Sie das folgende Programm aus: 80 °C, 2 Min. Platzieren Sie das Röhrchen dann auf dem Magneten Gestell sofort 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. Nachdem die Lösung geklärt ist, 10 μl Überstand vorsichtig in ein neues nukleasefreies PCR-Röhrchen aspirieren.

Schema B: Für RNA Bibliotheksvorbereitung

Fügen Sie gemäß den entsprechenden Kit-Anweisungen zum Aufbau der Bibliothek das entsprechende Volumen an Frag/Primer-Puffer hinzu.

Notiz

1. Bitte tragen Sie zu Ihrer Sicherheit und Gesundheit bei Operationen Laborkittel und Einweghandschuhe.
2. Nur für Forschungszwecke.
3. Erwärmen Sie die Magnetkügelchen unbedingt auf Raumtemperatur und mischen Sie sie gut, bevor Sie sie verwenden. Andernfalls kann die Rückgewinnungseffizienz der Proben beeinträchtigt werden.
4. Der Vorgang sollte streng frei von RNase- und Nukleinsäurekontaminationen sein.
5. Wenn dieses Produkt mit anderen Reagenzien verwendet wird, befolgen Sie bitte die spezifischen experimentellen Anweisungen zur Handhabung.
6. Um gute Reinigungsergebnisse zu erzielen, muss die Integrität der Gesamt-RNA gewährleistet sein und ein RIN-Wert von >7,0 sichergestellt werden.