Globin-mRNA-Depletionssonde (Mensch) wurde entwickelt, um menschliche Globin-mRNA zu entfernen. Es kann Globin-mRNA effektiv aus Erwachsenen, Säuglingen und Embryonen entfernennic Quellen, einschließlich HBA1/2, HBB, HBD, HBM, HBG1/2, HBE1, HBQ1 und HBZ. Dieses Produkt wird mit Hieff NGS verwendet^TM MaxUp rRNA-Depletion-Kit (Mensch/Maus/Ratte) (Yeasen#12253) zur effektiven Entfernung von rRNA und Globin-mRNA aus der Gesamt-RNA. Dieses Kit ist sowohl für intakte als auch für degradierte RNA-Proben geeignet. Die RNA-Proben nach der Entfernung von rRNA und Globin-mRNA können für Hochdurchsatz-Sequenzierungsanalysen von mRNA und nicht-kodierender RNA verwendet werden, was den Anteil gültiger Daten in den Sequenzierungsergebnissen sowie für die cDNA-Synthese oder andere nachgelagerte Anwendungen deutlich erhöht.

Produktanwendung

Geeignet für 100 ng~1 μg Gesamt-RNA-Proben vom Menschen, Blutressourcen von Mäusen und Ratten sowie für intakte und teilweise degradierte RNA-Proben.

Produktkomponenten

Versand und Lagerung

Alle Komponenten werden mit Trockeneis versendet und können ein Jahr lang bei -20°C gelagert werden.

Figur

Insgesamt wurden 500 ng und 100 ng menschliche Blut-Gesamt-RNA einer rRNA-Entfernung bzw. einer kombinierten rRNA- und Globin-Entfernung unterzogen. Nach dem Aufbau der Bibliothek und der Sequenzierung wurde der Gehalt an Globin-mRNA verglichen.

Vorsichtsmaßnahmen

1. Bitte verwenden Sie Verbrauchsmaterialien, die frei von RNase-Kontamination sind, und reinigen Sie den Versuchsbereich regelmäßig. Es wird empfohlen, ThermoFishers RNAZap zu verwenden^TM Hocheffizientes Nukleinsäure-Entfernungsspray zur Entfernung von RNase-Kontamination.

2. Die RNA-Probe sollte frei von genomischer DNA-Kontamination sein. Wenn gDNA in der Probe verbleibt, sollte sie vor der Verwendung durch DNase I verdaut und gereinigt werden.

3. Das maximale Eingangsvolumen der RNA-Probe beträgt 10 μL. Wenn das Probenvolumen groß ist, kann es zuerst konzentriert werden.

4. Bitte tragen Sie zu Ihrer Sicherheit und Gesundheit bei Operationen Laborkittel und Einweghandschuhe.

5. Nur für Forschungszwecke!

Anweisungen

1. Sondenhybridisierung mit RNA

1.1 Verdünnen Sie 10 ng–1 μg Gesamt-RNA mit nukleasefreiem Wasser auf ein Endvolumen von 10 μL in einem PCR-Röhrchen. Bewahren Sie die RNA auf Eis.

1.2 Montieren die folgende RNA/Sonde Hybridisierungsreaktion auf Eis gemäß Tabelle 1.

Tabelle 1 RNA/Sonde-Hybridisierungsreaktion

1.3 Durch mindestens 10-maliges, vorsichtiges Auf- und Abpipettieren gründlich mischen. Das Röhrchen in einer Mikrozentrifuge kurz zentrifugieren, um die Flüssigkeit von der Röhrchenwand zu sammeln.

1.4 Platzieren Sie das Röhrchen in einem Thermocycler und führen Sie das folgende Programm in Tabelle 2 mit dem auf 105 °C eingestellten Heizdeckel aus.

Tabelle 2 Reaktionsprogramm der RNA/Sonden-Hybridisierung

2. RNase H Verdauung

2.1 Stellen Sie die folgende RNase H-Verdauungsreaktion zusammen auf Eis gemäß Tabelle 3.

Tabelle 3 RNase H-Verdauungsreaktion

2.2 Mischen Sie gründlich, indem Sie mindestens 10 Mal vorsichtig auf und ab pipettieren. Zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz in einer Mikrozentrifuge, um die Flüssigkeit von der Seite des Röhrchens zu sammeln.

2.3 Platzieren Sie das Röhrchen in einem Thermocycler und führen Sie das folgende Programm aus: Deckel 50°C; 37°C, 30 Min.; 4°C, halten.

3. DNase ICH Verdauung

3.1 Stellen Sie die folgende DNase I-Verdauungsreaktion auf Eis gemäß Tabelle 4 zusammen.

Tabelle 4 DNase Ⅰ Verdauungsreaktion

3.2 Durch mindestens 10-maliges, vorsichtiges Auf- und Abpipettieren gründlich mischen. Das Röhrchen in einer Mikrozentrifuge kurz zentrifugieren, um die Flüssigkeit von der Röhrchenwand zu sammeln.

3.3 Platzieren Sie das Röhrchen in einem Thermocycler und führen Sie das folgende Programm aus: Deckel ab; 37°C, 30 Min.; 4°C, halten.

4. RNA-Reinigung

4.1 Äquilibrieren des Hieff NGS^TMRNA Cleaner (Kat.-Nr. 12602) auf Zimmertemperatur erwärmen und die Perlen vor Gebrauch durch Vortexen gründlich resuspendieren.

4.2 Hinzufügen 110 µl (2,2×) Perlen zur RNA-Lösung aus Schritt 3.3 hinzufügen und durch mindestens 10-maliges Auf- und Abpipettieren gründlich mischen.

4.3 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um RNA an die Perlen zu binden.

4.4 Stellen Sie das Röhrchen auf einen Magnetständer, um die Perlen vom Überstand zu trennen. Wenn die Lösung klar ist (nach ca. 3 Min.), entsorgen Sie den Überstand. Achten Sie darauf, die Perlen nicht mit der Pipettenspitze zu berühren.

4.5 Behalten Sie das Röhrchen auf dem Magnetständer. Geben Sie 200 µL frisch zubereiteten 80%igen Ethanol in das Röhrchen. Inkubieren Sie es 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur und entsorgen Sie dann den Überstand. Achten Sie darauf, die Perlen nicht mit den Pipettenspitzen zu berühren.

4.6 Wiederholen Sie Schritt 4.5 einmal für insgesamt zwei Waschvorgänge.

4.7 Restliches Ethanol mit 10 µL entfernen - Pipettenspitzen. Lassen Sie das Röhrchen auf dem Magnetständer und lassen Sie die Perlen bei geöffnetem Deckel bis zu 5 Minuten lang an der Luft trocknen.

4.8 Nehmen Sie das Röhrchen vom Magnetständer. Eluieren Sie die RNA von den Kügelchen, indem Sie 11 μl nukleasefreies Wasser hinzufügen. Mischen Sie gründlich, indem Sie mindestens 10 Mal auf- und abpipettieren, und zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz.

4.9 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Das Röhrchen auf den Magnetständer stellen, bis die Lösung klar ist (~ 3 Minuten).

4.10 Übertragen Sie 10 µl des Überstands in ein nukleasefreies Röhrchen.

Hinweis: Wenn Sie an diesem Punkt abbrechen müssen, können die Proben bei –80 °C gelagert werden.