Hieff NGS^TM DNA Library Prep Kit ist ein Bibliotheksbaukasten der neuen Generation, der speziell entwickelt und konzipiert wurde für Illumina® &MGI® SequenzierungsplattformBasierend auf der vorherigen Generation des Bibliotheksbaukastens weist dieses Produkt eine höhere Effizienz bei Endreparatur, dA-Tailing und Adapterligation auf als die Vorgängerversionen. Das hochpräzise Enzym verbessert die Einheitlichkeit und Genauigkeit der Amplifikation deutlich. Der Baukasten ist mit den meisten DNA-Probentypen kompatibel, einschließlich genomischer Standard-DNA von Tieren/Pflanzen/Mikroorganismen, FFPE-Proben, cfDNA und ChIP-DNA.

Technische Daten

Komponenten

Lagerung

Dieses Produkt sollte bei -25~-15℃ für 1 gelagert werden Jahr.

Hinweise

1. Über die Operation

1. Bitte operieren Sie mit Laborkitteln und Einweghandschuhen，zu Ihrer Sicherheit.

2. Komponenten bei Raumtemperatur auftauen. Nach dem Auftauen, durch Vortexen gründlich mischen, das Röhrchen kurz zentrifugieren und zur späteren Verwendung auf Eis legen.

3. Bei der Vorbereitung der Reaktionslösung für jeden Schritt wird empfohlen, diese mit einer Pipette gut zu vermischen oder vorsichtig zu schütteln. Starkes Schütteln kann zu einer Verringerung der Bibliotheksleistung führen.

4. Um Kreuzkontaminationen zu vermeiden, wird die Verwendung von Pipettenspitzen mit Filter dringend empfohlen. Wechseln Sie die Pipettenspitzen bei der Verarbeitung unterschiedlicher Proben.

5. Unsachgemäße Handhabung kann sehr wahrscheinlich zu Aerosolkontaminationen führen, die die Genauigkeit des Ergebnisses beeinträchtigen. Eine obligatorische physische Isolierung der PCR-Reaktionsmischbereiche und der PCR-Produktreinigungsassaybereiche wird empfohlen. Ausgestattet mit Geräten wie Spezialpipetten für den Bibliotheksaufbau.Führen Sie für jeden Bereich eine Routinereinigung durch, indem Sie die Oberflächen mit 0,5 % Natriumhypochlorit oder 10 % Bleichmittel abwischen

6. Dieses Produkt ist nur für Forschungszwecke bestimmt.

2. DNA-Fragmentierung

1. Dieses Kit ist entweder mit mechanisch fragmentierter oder enzymatisch fragmentierter DNA kompatibel.

2. Das Kit ist mit 100 pg bis 1000 ng DNA kompatibel. Es wird dringend empfohlen, hochwertige DNA mit einem A260/A280-Wert von 1,8–2,0 zu verwenden. Die empfohlene DNA-Menge ist in Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1 Die empfohlene Menge an Input-DNA

Notiz: Wenn die eingegebene DNA von schlechter Qualität ist oder eine Auswahl der DNA-Größe erforderlich ist, sollte die eingegebene DNA-Menge entsprechend erhöht werden.

3. „Input-DNA“ bezieht sich speziell auf die DNA-Proben, die für die Endreparatur/das dA-Tailing bereit sind.

4. Ein Schritt zur Perlenreinigung/Größenauswahl wird nach der Fragmentierung empfohlen, wenn die DNA-Probe hohe Konzentrationen an Salzen wie dem Metallchelatbildner enthält. Die Salze können die Effizienz der folgenden Reaktionen, einschließlich der Endreparatur und des dA-Tailings, beeinträchtigen.Bei Verwendung der mechanischen Fragmentierungsmethode eluieren Sie die DNA-Proben zur Fragmentierung bitte in TE-Puffer anstelle von sterilisiertem Reinstwasser. Bei Verwendung der enzymatischen Fragmentierungsmethode ohne vorherige Reinigung oder Größenselektion der Beads vor der Bibliotheksvorbereitung stellen Sie bitte sicher, dass der verwendete Stopppuffer nicht zu viel Metallchelatbildner enthält. Andernfalls reinigen oder selektieren Sie die fragmentierten Proben und eluieren Sie sie in TE-Puffer oder sterilisiertem Reinstwasser (≤ 50 μl), bevor Sie mit der Bibliotheksvorbereitung fortfahren.

3. Adapterligatur

1. Es stehen Illumina- oder MGI-Langadapter-Kits (Barcode-Adapter) und Kurzadapter-Kits zur Auswahl, die den Kunden entsprechend ihren experimentellen Anforderungen zur Verfügung stehen.

2. Es wird empfohlen, hochwertige, kommerzielle Adapter zu verwenden. Bei der Auswahl selbst hergestellter Adapter sollte ein Unternehmen mit Erfahrung in der NGS-Primersynthese beauftragt werden. Beachten Sie die Notwendigkeit einer strengen Kontaminationskontrolle. Darüber hinaus wird empfohlen, die DNA-Annealing-Lösung in einer Reinraumbank vorzubereiten und jeweils nur einen Adaptertyp zu verwenden, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.

3. Tauen Sie die Adapter bitte auf Eis oder bei 4°C auf, bei Betrieb bei Raumtemperatur sollte die Labortemperatur 25°C nicht überschreiten, um eine Denaturierung der Adapter zu vermeiden.

4. Die Qualität und Konzentration der Adapter beeinflussen direkt die Ligationseffizienz und die Bibliotheksausbeute. Eine zu hohe Adapterkonzentration begünstigt die Dimerbildung, während eine zu geringe Adapterkonzentration die Ligationsrate und die Bibliotheksausbeute verringert. Die entsprechenden Verdünnungen mit TE-Puffer richten sich nach der DNA-Eingangsmenge bei Verwendung des Adapters. Tabelle 2 -5 listet die empfohlenen Adapterverdünnungsmethoden für unterschiedliche Input-DNA-Mengen bei Verwendung dieses Kits auf.

Tabelle 2 Das empfohlene Illumina™ Adaptermenge für unterschiedliche Eingangs-DNA

Tabelle 3 Das empfohlene MGI™ Adaptermenge für unterschiedliche Eingangs-DNA

Tabelle 4 Das empfohlene Illumina™ UMI-Adaptermenge für verschiedene Eingabe-DNA

Tabelle 5 Das empfohlene MGI™ UMI-Adaptermenge für verschiedene Eingabe-DNA

4. Bead-basierte DNA-Reinigung und Größenauswahl

1. Die DNA-Größenauswahl kann vor der Endreparatur/dA-Tailing, nach der Adapterligation oder nach der Amplifikation durchgeführt werden.

2. Es wird empfohlen, die Größenauswahl direkt nach der Adapterligation durchzuführen, wenn die eingegebene DNA-Menge mehr als 50 ng beträgt; Andernfalls führen Sie die Größenauswahl bitte nach der Verstärkung durch.

3. Der Ligation Enhancer enthält eine hohe PEG-Konzentration, die die genaue Größenauswahl erheblich beeinträchtigen kann. Wenn die Größenauswahl direkt nach der Adapterligation erfolgen soll, wird daher dringend empfohlen, vor der Größenauswahl einen Perlenreinigungsschritt durchzuführen. Die Größenauswahl kann direkt durchgeführt werden, wenn sie vor der Endreparatur/dA-Tailing oder nach die Bibliotheksverstärkung.

4. Die Magnetkügelchen sollten vor der Verwendung auf Raumtemperatur gebracht werden, da sonst die Ausbeute abnimmt und der Größenauswahleffekt beeinträchtigt wird.

5. Die Magnetkügelchen sollten vor der Verwendung durch Vortexen oder Pipettieren gut gemischt werden.

6. Beim Übertragen des Überstands dürfen die Kügelchen nicht abgesaugt werden, da selbst kleinste Mengen der Kügelchen die folgenden Reaktionen beeinträchtigen können.

7. Der 80%ige Ethanol sollte frisch zubereitet werden, da sonst die Rückgewinnungseffizienz beeinträchtigt wird.

8. Für eine genaue Größenauswahl empfiehlt es sich, mit einem Volumen von mehr als 100 μl zu beginnen. Bei einem geringeren Volumen empfiehlt es sich, das Volumen mit ultrareinem Wasser auf 100 μl zu bringen.

9. Die Magnetkügelchen sollten vor der Elution des Produkts bei Raumtemperatur getrocknet werden. Unzureichende Trocknung führt leicht zu Ethanolrückständen, die nachfolgende Reaktionen beeinträchtigen; übermäßige Trocknung führt zum Reißen der Magnetkügelchen und verringert die Reinigungsausbeute. Normalerweise reicht eine Trocknung bei Raumtemperatur von 3–5 Minuten aus, um die Kügelchen vollständig trocknen zu lassen.

10. Bei Bedarf werden die gereinigten oder größenselektierten DNA-Proben in 0,1× TE-Puffer kann 1–2 Wochen bei 4 °C oder einen Monat bei -20 °C gelagert werden.

5. Bibliothekserweiterung

1. Ob eine Bibliotheksamplifikation durchgeführt wird, hängt von der Menge der DNA-Input-DNA, den Adaptertypen, den Sequenzierungsdatenanwendungen usw. ab. Bei Verwendung von Teiladaptern ist der Amplifikationsschritt erforderlich. Bei Verwendung von Volllängenadaptern wird eine Amplifikation empfohlen, wenn die Input-DNA <200 ng beträgt; andernfalls ist eine Amplifikation nicht erforderlich.

2. Die Anzahl der Amplifikationszyklen sollte streng kontrolliert werden. Unzureichende Amplifikation kann zu einer geringen Bibliotheksausbeute führen; Überamplifikation kann zu erhöhter Verzerrung, Fehlern, doppelten Lesevorgängen und chimären Produkten führen. Tabelle 6 listet empfohlene Zykluszahlen auf, die auf eine Bibliotheksausbeute von 1 μg abzielen.

Tabelle 6 Die empfohlene Anzahl von Zyklen zur Erzeugung 1.000 ng Bibliotheksausbeute

Notiz:

1.Tabelle 6 zeigt die Anzahl der Schleifenparameter bei Verwendung hochwertiger Input-DNA-Tests von etwa 200 bp. Die FFPE-DNA-Qualität variiert stark, und wenn die DNA-Qualität schlecht oder die Bibliothekslänge groß ist, muss die Anzahl der Zyklen entsprechend erhöht werden, um ausreichend Bibliotheken zu erhalten.

2.ICHWenn während des Bibliotheksaufbauprozesses eine Größenauswahl erforderlich ist, wird eine höhere Zykluszahl für die Bibliotheksamplifikation empfohlen; andernfalls wird eine niedrigere Zykluszahl empfohlen.

3.ICHWenn unvollständige Adapter verwendet werden, müssen mindestens 2 Zyklen verstärkt werden, um einen vollständigen Adapter zu bilden.

6. Analyse der Bibliotheksqualität

1. Die Qualität der erstellten Bibliotheken wird im Allgemeinen durch Messen der Konzentrationen und Größenverteilungen analysiert.

2. Die Konzentrationen von Bibliotheken können mit fluoreszenzbasierten Methoden wie Qubit und PicoGreen oder qPCR gemessen werden.

3. Es wird NICHT empfohlen, absorptionsbasierte Quantifizierungsmethoden wie NanoDrop zu verwenden.

4. Es wird empfohlen, die qPCR-Methode zur Quantifizierung von Bibliotheken zu verwenden: Fluoreszenzbasierte Methoden wie Qubit und PicoGreen können unvollständige dsDNA-Strukturen (Inserts ohne Adapter oder mit nur einem Ende mit Adapter ligiert) nicht von vollständigen Bibliotheken unterscheiden. Die qPCR-Methode amplifiziert und misst nur vollständige Bibliotheken mit beiden Enden mit Adaptern ligiert (die sequenzierbaren Bibliotheken) und ermöglicht so eine genauere Messung beim Laden.

5.Die Größenverteilung von Bibliotheken kann mit Agilent Bioanalyzer oder anderen Geräten analysiert werden, die auf den Prinzipien der Kapillarelektrophorese oder Mikrofluidik basieren.

7. Sonstige Materialien

1. Magnetische Beads zur DNA-Reinigung: Hieff NGS^TM DNA-Selektionsperlen (Yeasen Kat.-Nr. 12601) oder AMPure^® XP Beads (A63880) oder andere gleichwertige Produkte.

2. Adapter: Komplettadapter für Illumina: Yeasen Kat.-Nr. 13519-13520; 384 Dual-CDI-Zündhütchen: Yeasen Katze Nr. 12412 – Katze Nr. 12413; 384 Unique Dual Index (UDI)-Primer: Yeasen Katze Nr. 12312~Katze Nr. 12315; UMI UDI-Adapter: Yeasen Kat.-Nr. 13370~Kat.-Nr. 13371; Komplettadapter für MGI: Yeasen Kat.-Nr. 13360-13362. DNA-Primer-Mix:Katze#12190 oder Katze#12191.

3. Qualitätsanalyse der Bibliothek: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/High Sensitivity Chip oder andere gleichwertige Produkte; quantitative Reagenzien der Bibliothek.

4. Andere Materialien: absoluter Ethanol, steriles Reinstwasser, Pipettenspitzen mit geringer Retention, PCR-Röhrchen, Magnetständer, Thermocycler usw.

Anweisungen

Schritt 1. Endreparatur/dA-Taling

1. Auftauen die in Tabelle genannten Reagenzien 7 . Drehen Sie die Reagenzien um, um sie gründlich zu vermischen, und legen Sie sie zur späteren Verwendung auf Eis.

2. Stellen Sie die Reagenzien gemäß Tabelle zusammen 7 auf Eis.

Tisch 7 Endreparatur/ dA-Tailing-Reaktionssystem

3. Durch Pipettieren oder Schütteln vorsichtig mischen. Kurz zentrifugieren, um die Lösung zu erhalten.

4. Platzieren Sie das Röhrchen in einem Thermocycler und stellen Sie das Programm gemäß Tabelle 8 ein.

Tabelle 8 Endreparatur/dA-Tailing Reaktionsprogramm

Schritt 2. Adapterligatur

1. Verdünnen Sie den Adapter auf die entsprechende Konzentration gemäß Tabelle 2-5.

2. Auftauen die in Tabelle genannten Reagenzien 9 . Drehen Sie die Reagenzien um, um sie gründlich zu vermischen, und legen Sie sie zur späteren Verwendung auf Eis.

3. Stellen Sie die Reagenzien gemäß Tabelle zusammen 9 auf Eis.

Tabelle 9 Adapterligatur Reaktionssystem

Notiz: *Der Ligationsverstärker ist viskos. Bitte gründlich durch Umdrehen oder Umdrehen mischen und vor Gebrauch kurz zentrifugieren.

**Die ursprüngliche Konzentration der Illumina^TM Adapter von YEASE beträgt 15 μM. Bitte verdünnen Sie den Adapter entsprechend der Eingangsmenge Und Stellen Sie das Volumen des Adapters auf 5 μL ein.

**Die ursprüngliche Konzentration des MGI^TM Adapter von YEASE ist 10 μM. Bitte verdünnen Sie den Adapter entsprechend der Eingangsmenge Und Stellen Sie das Volumen des Adapters auf 5 μL ein.

4. Durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren gründlich mischen und kurz zentrifugieren, um die gesamte Flüssigkeit von den Seiten des Röhrchens zu sammeln.

5. Inkubieren Sie die Probe in einem vorgeheizten Thermocycler, wie in Tabelle 10 gezeigt und führen Sie die Adapterverbindungsreaktion durch.

Tabelle 10 Adapterligationsreaktionsprogramm

Schritt 3. Bereinigung oder Größenauswahl nach Adapterligatur

Dieser Schritt dient der Reinigung oder Größenauswahl des Produkts aus Schritt 2 mit magnetischen Beads. Durch die Reinigung können Adapterrückstände, Adapterdimere oder andere unbrauchbare Produkte entfernt werden.

CleaN von Adapter-ligierter DNA

1. Vorbereitung: Nehmen Sie den Hieff NGS^TM DNA-Selektionsperlen aus dem Kühlschrank nehmen und mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. 80%igen Ethanol frisch zubereiten.

2. Mischen Sie die Perlen gründlich durch Umdrehen oder Kippen.

3. Addiere 88 μL Hieff NGS^TM DNA-Selektionskügelchen (0,8×, Kügelchen : DNA = 0,8:1) in das Röhrchen mit dem Adapter-ligierten Produkt geben, schütteln und gut mischen und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

4. Zentrifugieren Sie kurz, um die Lösung zu erhalten, und stellen Sie das Zentrifugenröhrchen auf das Magnetgestell. Nachdem die Magnetkügelchen vollständig adsorbiert sind (ca. 5 Minuten), entfernen Sie vorsichtig die Flüssigkeit.

5. Halten Sie das Rohr auf dem Magnetständer, 200 μL frisch zubereiteten 80%igen Ethanol direkt in das Röhrchen geben. 30 Sekunden bei Raumtemperatur inkubieren und die Flüssigkeit vorsichtig entfernen.

6. Wiederholen Führen Sie erneut Schritt 5 aus.

7. Bewahren Sie das Röhrchen auf dem Magnetständer auf, öffnen Sie die Kappe und trocknen Sie die Perlen, bis sie gerade Risse aufweisen (nicht länger als 5 Minuten).

8. Nehmen Sie das Röhrchen zur Elution vom Magnetständer und eluieren die DNA

1). Wenn das Produkt nicht größenmäßig ausgewählt werden muss, fügen Sie 21 μL ddH hinzu₂O direkt. Gründlich mischen durch Vortexen oder 10-maliges Auf- und Abpipettieren. 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Das Röhrchen kurz zentrifugieren und auf einen Magnetständer stellen. Sobald die Lösung klar ist (ca. 5 Minuten), 20 μl Überstand vorsichtig in ein neues PCR-Röhrchen überführen, ohne die Magnetkügelchen zu berühren.

2). Wenn die Produktgröße ausgewählt werden muss, fügen Sie 102 μL ddH hinzu₂O direkt. Gründlich mischen durch Vortexen oder 10-maliges Auf- und Abpipettieren. 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Das Röhrchen kurz zentrifugieren und auf einen Magnetständer stellen. Sobald die Lösung klar ist (ca. 5 Minuten), 100 μl Überstand vorsichtig in ein neues PCR-Röhrchen überführen, ohne die Magnetkügelchen zu berühren.

Notiz: Wenn das gereinigte Produkt gelagert werden muss, kann es mit TE-Puffer eluiert werden.

Größenauswahl von Adapter-ligierter DNA

1.Vorbereitung: Nehmen Sie den Hieff NGS^TM DNA-Selektionsperlen aus dem Kühlschrank nehmen und mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. 80%igen Ethanol frisch zubereiten.

2. Mischen Sie die Perlen gründlich durch Umdrehen oder Kippen.

3. Basierend auf den Zielgrößen fügen Sie die erste Runde Perlen zu den 100 μL gereinigten DNA-Vorlagen gemäß Tabelle hinzu 11. Gründlich durch Vortexen oder 10-maliges Pipettieren mischen.

Tisch 11 Empfohlene Beads:DNA-Verhältnisse für die perlenbasierte Größenauswahl

Notiz: „ד in der Tabelle gibt das Volumen der DNA-Probe an. Beträgt beispielsweise die Insertlänge der Bibliothek 250 bp und das DNA-Probenvolumen 100 μl, beträgt das Volumen der in der ersten Sortierrunde verwendeten Magnetkügelchen 0,7 × 100 μl = 70 μl; das Volumen der in der zweiten Sortierrunde verwendeten Magnetkügelchen beträgt 0,20 × 100 μl = 20 μl. Das in der Tabelle empfohlene Kügelchenvolumen gilt für die adapterligierte DNA. Wenn vor der Ligation eine Größenauswahl durchgeführt wird, beachten Sie bitte die Herstellungsprotokolle von Hieff NGS.^TM DNA-Selektionsperlen (Kat.-Nr. 12601).

4. 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

5. Das Röhrchen kurz zentrifugieren und auf einen Magnetständer stellen. Sobald die Lösung klar ist (nach ca. 5 Minuten), den Überstand in ein neues PCR-Röhrchen überführen.

6. Fügen Sie die zweite Runde der Auswahlperlen zur Probe aus Schritt 5 hinzu gemäß Tabelle 11. Gründlich mischen, indem mindestens 10-mal auf und ab gevortext oder pipettiert wird.

7. 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

8. Zentrifugieren Sie kurz, um die Lösung zu erhalten, und stellen Sie das Zentrifugenröhrchen auf das Magnetgestell. Nachdem die Magnetkügelchen vollständig adsorbiert sind (ca. 5 Minuten), entfernen Sie die Flüssigkeit vorsichtig.

9. Halten Sie das Rohr auf dem Magnetständer, 200 μL frisch zubereiteten 80%igen Ethanol direkt in das Röhrchen geben. 30 Sekunden bei Raumtemperatur inkubieren und die Flüssigkeit vorsichtig entfernen.

10. Wiederholen Schritt 9 wieder.

11. Bewahren Sie das Röhrchen auf dem Magnetständer auf, öffnen Sie die Kappe und trocknen Sie die Perlen, bis sie gerade Risse aufweisen (nicht länger als 5 Minuten).

12. Nehmen Sie das Röhrchen zur Elution vom Magnetständer und direkt 21 μL ddH hinzufügen₂O. Gründlich durch Vortexen oder Auf- und Abpipettieren mischen und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. (Hinweis: Falls das gereinigte Produkt gelagert werden muss, bitte in TE-Puffer eluieren.) Das Röhrchen kurz zentrifugieren und auf einen Magnetständer stellen, bis die Flüssigkeit klar wird (ca. 5 Minuten). 20 μl Überstand vorsichtig in ein neues PCR-Röhrchen überführen, ohne die Beads zu berühren.

Schritt 4 Bibliothekserweiterung

Dieser Schritt kann die gereinigten oder größenselektierten Produkte durch PCR-Amplifikation anreichern.

1. Tauen Sie die in Tabelle 12 aufgeführten Reagenzien auf, drehen Sie sie um, mischen Sie sie gründlich und legen Sie sie zur späteren Verwendung auf Eis.

2. Stellen Sie die folgende Reaktion in einem sterilisierten PCR-Röhrchen zusammen.

Tabelle 12 Adapter-ligierte DNA-PCR-Reaktion System

[Notiz]: * wenn der komplette Adapter verwendet wurde, Hieff NGS^TM Grundierungsmischung (Yeasen Kat.-Nr. 12190 oder Kat.-Nr. 12191) in benötigt; Wenn ein unvollständiger Adapter verwendet wird (Cat#12412~Cat#12413, Cat#12312~Katze Nr. 12315, Kat.-Nr. 13370~Kat.-Nr. 13371), beachten Sie bitte die Anweisungen des Kits und verwenden Sie zur Amplifikation den im Kit enthaltenen Indexprimer.

3. Durch Pipettieren oder Schütteln vorsichtig mischen und kurz zentrifugieren, um die Lösung zu erhalten.

4. Legen Sie das Röhrchen in einen Thermocycler und richten Sie das Programm gemäß Tabelle 13 ein um die Verstärkung zu starten.

Tabelle 13 PCR-Amplifikationsreaktionsprogramm

Schritt 5 Aufreinigung/Größenauswahl nach der Amplifikation

Die saubere Aufwärtsschritte beziehen sich Schritt 3. Hieff NGS^TM DNA-Selektionsperlen (0,9×, Perlen:DNA=0,9:1) werden zur Reinigung des PCR-Produkts verwendet. Falls eine Größenauswahl erforderlich ist, beachten Sie bitte Schritt 3.

Schritt 6 Qualitätskontrolle der endgültigen Bibliotheken

Die Qualität der erstellten Bibliothek wird im Allgemeinen durch Messung der Konzentration und Größenverteilung bewertet. Einzelheiten finden Sie in Anmerkung 6.