Hieff NGS^TM DNA Library Prep Kit ist ein Bibliotheksbaukasten der neuen Generation, der speziell entwickelt und konzipiert wurde für Illumina® &MGI® Sequenzierungsplattform. Basierend auf der vorherigen Generation des Bibliotheksbaukastens weist dieses Produkt eine höhere Effizienz bei Endreparatur, dA-Tailing und Adapterligation auf als die vorherigen Versionen. Das hochpräzise Enzym verbessert die Einheitlichkeit und Genauigkeit der Amplifikation erheblich. Der Baukasten ist mit den meisten DNA-Probentypen kompatibel, einschließlich standardmäßiger genomischer DNA von Tieren/Pflanzen/Mikroorganismen, FFPE-Proben, cfDNA und ChIP-DNA.

Technische Daten

Komponenten

Lagerung

Dieses Produkt sollte bei -25~-15℃ gelagert werden für 1 Jahr.

Hinweise

1. Über die Operation

1. Bitte arbeiten Sie zu Ihrer Sicherheit mit Laborkitteln und Einweghandschuhen.

2. Komponenten bei Raumtemperatur auftauen. Nach dem Auftauen, durch Vortexen gründlich mischen, das Röhrchen kurz zentrifugieren und zur späteren Verwendung auf Eis legen.

3. Beim Vorbereiten der Reaktionslösung für jeden Schritt wird empfohlen, sie mit einer Pipette gut zu vermischen oder vorsichtig zu schütteln. Kräftiges Schütteln kann zu einer Verringerung der Bibliotheksausgabe führen.

4. Es wird dringend empfohlen, gefilterte Pipettenspitzen zu verwenden, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Achten Sie darauf, die Pipettenspitzen zu wechseln, wenn Sie verschiedene Proben verarbeiten.

5. Unsachgemäße Handhabung kann sehr wahrscheinlich zu Aerosolverunreinigungen führen, die die Genauigkeit des Ergebnisses beeinträchtigen. Eine obligatorische physische Isolierung der PCR-Reaktionsmischbereiche und der PCR-Produktreinigungstestbereiche wird empfohlen. Ausgestattet mit Geräten wie Spezialpipetten für den Bibliotheksaufbau.Führen Sie eine Routinereinigung für jeden Bereich durch, indem Sie die Oberflächen mit 0,5 % Natriumhypochlorit oder 10 % Bleichmittel abwischen.

6. Dieses Produkt ist nur für Forschungszwecke bestimmt.

2. DNA-Fragmentierung

1. Dieses Kit ist entweder mit mechanisch fragmentierter oder enzymatisch fragmentierter DNA kompatibel.

2. Das Kit ist mit 100 pg - 1000 ng Eingangs-DNA kompatibel. Es wird dringend empfohlen, hochwertige Eingangs-DNA mit A260/A280 = 1,8-2,0 zu verwenden. Tabelle 1 listet die empfohlene Menge an Eingangs-DNA auf.

Tabelle 1 Die empfohlene Menge an Input-DNA

Notiz: Wenn die eingegebene DNA von schlechter Qualität ist oder eine Auswahl der DNA-Größe erforderlich ist, sollte die eingegebene DNA-Menge entsprechend erhöht werden.

3.„Input-DNA“ bezieht sich speziell auf die DNA-Proben, die für die Endreparatur/das dA-Tailing bereit sind.

4. Nach der Fragmentierung wird ein Schritt zur Perlenreinigung/Größenauswahl empfohlen, wenn die DNA-Eingangsprobe hohe Konzentrationen an Salzen wie dem Metallchelatbildner enthält. Die Salze können die Effizienz der folgenden Reaktionen, einschließlich Endreparatur und dA-Tailing, beeinträchtigen. Bitte eluieren Sie die DNA-Proben zur Fragmentierung in TE-Puffer statt in sterilisiertem Reinstwasser, wenn Sie die mechanische Fragmentierungsmethode verwenden. Wenn Sie die enzymatische Fragmentierungsmethode verwenden, ohne eine Perlenreinigung oder Größenauswahl durchzuführen, bevor Sie mit der Bibliotheksvorbereitung fortfahren, stellen Sie bitte sicher, dass der verwendete Stopppuffer nicht zu viel Metallchelatbildner enthält. Andernfalls reinigen oder wählen Sie die fragmentierten Proben nach Größe aus und eluieren Sie sie in TE-Puffer oder sterilisiertem Reinstwasser (≤ 50 μL), bevor Sie mit der Bibliotheksvorbereitung fortfahren.

3. Adapterligatur

1. Kunden können je nach ihren experimentellen Anforderungen zwischen langen Adapter-Kits (Adapter mit Strichcode) und kurzen Adapter-Kits von Illumina oder MGI wählen.

2. Es wird empfohlen, hochwertige, kommerzielle Adapter auszuwählen. Wenn Sie sich für selbst hergestellte Adapter entscheiden, vertrauen Sie diese bitte einem Unternehmen mit Erfahrung in der NGS-Primersynthese an und weisen Sie auf die Notwendigkeit einer strengen Kontaminationskontrolle hin. Darüber hinaus wird empfohlen, die DNA-Annealing-Lösung in einer Reinraumbank vorzubereiten und jedes Mal nur einen Adaptertyp zu verwenden, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden..

3. Tauen Sie die Adapter bitte auf Eis oder bei 4°C auf, bei Betrieb bei Raumtemperatur sollte die Labortemperatur 25°C nicht überschreiten, um eine Denaturierung der Adapter zu vermeiden.

4. Die Qualität und Konzentration der Adapter wirken sich direkt auf die Ligationseffizienz und die Bibliotheksausbeute aus. Eine zu hohe Adapterkonzentration begünstigt die Bildung von Adapterdimeren, während eine zu geringe Adapterkonzentration die Ligationsrate und die Bibliotheksausbeute verringert. Entsprechende Verdünnungen mit TE-Puffer je nach DNA-Eingangsmenge bei Verwendung von Adaptern.Tabelle 2 -5 listet die empfohlenen Adapter-Verdünnungsmethoden für unterschiedliche Input-DNA-Mengen bei Verwendung dieses Kits auf.

Tisch 2 Die empfohlene Illumina^TM Adaptermenge für verschiedene Eingänge DNA

Tisch 3 Der empfohlene MGI^TM Adaptermenge für verschiedene Eingänge DNA

Tisch 4 Die empfohlene Illumina^TM UMI Adaptermenge für verschiedene Eingänge DNA

Tisch 5 Der empfohlene MGI^TM UMI Adapter einMAnzahl für verschiedene Eingaben DNA

4. DNA-Reinigung und Größenauswahl auf Perlenbasis

1. Die DNA-Größenauswahl kann vor der Endreparatur/dA-Tailing, nach der Adapterligatur oder nach der Amplifikation durchgeführt werden.

2. Es wird empfohlen, die Größenauswahl direkt nach der Adapterligation durchzuführen, wenn die eingegebene DNA-Menge mehr als 50 ng beträgt; Andernfalls führen Sie die Größenauswahl bitte nach der Verstärkung durch.

3. Der Ligation Enhancer enthält eine hohe Konzentration an PEG, was die genaue Größenauswahl erheblich beeinträchtigen kann. Wenn die Größenauswahl direkt nach der Adapterligatur durchgeführt werden soll, wird daher dringend empfohlen, vor der Größenauswahl einen Perlenreinigungsschritt hinzuzufügen. Der Schritt zur Größenauswahl kann direkt durchgeführt werden, wenn er vor der Endreparatur/dA-Tailing oder nach die Bibliotheksverstärkung.

4. Die magnetischen Perlen sollten vor der Verwendung auf Raumtemperatur gebracht werden, da sich sonst die Ausbeute verringert und der Größenauswahleffekt beeinträchtigt wird.

5. Die magnetischen Perlen sollten vor der Verwendung durch Vortexen oder Pipettieren gut gemischt werden.

6. Saugen Sie die Perlen beim Übertragen des Überstands nicht ab, selbst kleinste Mengen der Perlen können die folgenden Reaktionen beeinträchtigen.

7. Der 80-prozentige Ethanol muss frisch zubereitet werden, da sonst die Rückgewinnungseffizienz beeinträchtigt wird.

8. Für eine genaue Größenauswahl wird empfohlen, mit einem Volumen von mehr als 100 μL zu beginnen. Wenn das Volumen geringer ist, wird empfohlen, das Volumen mit ultrareinem Wasser auf 100 μL zu bringen.

9. Die Magnetkügelchen sollten vor dem Eluieren des Produkts bei Raumtemperatur getrocknet werden. Bei unzureichender Trockenheit können Ethanolrückstände leicht nachfolgende Reaktionen beeinträchtigen; bei übermäßiger Trockenheit reißen die Magnetkügelchen und die Reinigungsausbeute wird reduziert. Normalerweise reicht es aus, die Kügelchen 3–5 Minuten bei Raumtemperatur trocknen zu lassen, damit sie vollständig trocknen.

10. Bei Bedarf werden die gereinigten oder nach Größe selektierten DNA-Proben in 0,1× TE-Puffer kann 1–2 Wochen bei 4 °C oder einen Monat bei -20 °C gelagert werden.

5. Bibliothekserweiterung

1. Ob eine Bibliotheksamplifikation durchgeführt werden soll oder nicht, hängt von der Menge der eingegebenen DNA, den Adaptertypen, den Sequenzierungsdatenanwendungen usw. ab. Der Amplifikationsschritt ist erforderlich, wenn Teiladapter verwendet werden. Bei Verwendung von Adaptern voller Länge wird eine Amplifikation empfohlen, wenn die eingegebene DNA <200 ng ist; andernfalls ist eine Amplifikation nicht erforderlich.

2. Die Anzahl der Amplifikationszyklen sollte streng kontrolliert werden. Unzureichende Amplifikation kann zu einer geringen Bibliotheksausbeute führen; Überamplifikation kann zu erhöhter Verzerrung, Fehlern, doppeltem Lesen und chimären Produkten führen. Tabelle 6 listet empfohlene Zykluszahlen auf, die auf eine Bibliotheksausbeute von 1 μg abzielen.

Tisch 6 Die empfohlene Anzahl von Zyklen zur Erzeugung 1.000 ng Bibliotheksausbeute

Notiz:

1.Tisch 6 zeigt die Anzahl der Loop-Parameter bei Verwendung hochwertiger Input-DNA-Tests von etwa 200 bp. Die FFPE-DNA-Qualität variiert stark, und bei schlechter DNA-Qualität oder großer Bibliothekslänge muss die Anzahl der Zyklen entsprechend erhöht werden, um ausreichend Bibliotheken zu erhalten.

2.ICHWenn beim Erstellen der Bibliothek eine Größenauswahl erforderlich ist, wird eine höhere Zyklenzahl für die Bibliotheksamplifikation empfohlen; andernfalls wird eine niedrigere Zyklenzahl empfohlen.

3.ICHBei Verwendung unvollständiger Adapter müssen mindestens 2 Zyklen verstärkt werden, um einen vollständigen Adapter zu bilden.

6. Analyse der Bibliotheksqualität

1. Die Qualität der erstellten Bibliotheken wird im Allgemeinen durch Messen der Konzentrationen und Größenverteilungen analysiert.

2. Bibliotheken'Konzentrationen können mit fluoreszenzbasierten Methoden wie Qubit und PicoGreen oder qPCR gemessen werden.

3.Es wird NICHT empfohlen, absorptionsbasierte Quantifizierungsmethoden wie NanoDrop zu verwenden.

4. Es wird empfohlen, die qPCR-Methode zur Quantifizierung der Bibliothek zu verwenden: Fluoreszenzbasierte Methoden wie Qubit und PicoGreen können die unvollständigen dsDNA-Strukturen (Inserts ohne Adapter oder mit nur einem der mit Adapter ligierten Enden) nicht von den vollständigen Bibliotheken unterscheiden. Die qPCR-Methode amplifiziert und misst nur die vollständigen Bibliotheken, deren beide Enden mit Adaptern ligiert sind (die sequenzierbaren Bibliotheken) und bietet somit eine genauere Messung zum Laden.

5. Die Größenverteilung von Bibliotheken kann mit Agilent Bioanalyzer oder anderen Geräten analysiert werden, die auf den Prinzipien der Kapillarelektrophorese oder Mikrofluidik basieren.

7. Andere Materialien

1. Magnetkügelchen zur DNA-Reinigung: Hieff NGS^TM DNA-Selektionsperlen (Yeasen Cat#12601) oder AMPure^® XP Beads (A63880) oder andere gleichwertige Produkte.

2. Adapter: Komplettadapter für Illumina: Yeasen Kat.-Nr.: 13519-13520; 384 Dual-CDI-Zündhütchen: Ja Katze Nr. 12412 ~ Katze Nr. 12413; 384 Unique Dual Index (UDI)-Primer: Yeasen Katze#12312~Katze Nr. 12315; UMI UDI-Adapter: Ja Katze Nr. 13370 ~ Katze Nr. 13371; Komplettadapter für MGI: Yeasen Cat#13360-13362. DNA-Primer-Mix:Katze#12190 oder Katze#12191.

3. Qualitätsanalyse der Bibliothek: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/High Sensitivity Chip oder andere gleichwertige Produkte; quantitative Reagenzien für die Bibliothek.

4. Andere Materialien: absoluter Ethanol, steriles Reinstwasser, Pipettenspitzen mit geringer Retention, PCR-Röhrchen, Magnetständer, Thermocycler usw.

Anweisungen

Schritt 1. Endreparatur/dA-Taling

1. Auftauen die in Tabelle 1 genannten Reagenzien 7 . Drehen Sie die Reagenzien um, um sie gründlich zu vermischen, und legen Sie sie zur späteren Verwendung auf Eis.

2. Stellen Sie die Reagenzien gemäß Tabelle zusammen 7 auf Eis.

Tisch 7 Endreparatur/ dA-Tailing-Reaktionssystem

3. Durch Pipettieren oder Schütteln vorsichtig mischen. Kurz zentrifugieren, um die Lösung zu erhalten.

4. Setzen Sie das Röhrchen in einen Thermocycler ein und stellen Sie das Programm gemäß Tabelle 8 ein.

Tisch 8 Endreparatur/dA-Tailing Reaktionsprogramm

Schritt 2. Adapterligatur

1. Verdünnen Sie den Adapter auf die entsprechende Konzentration gemäß Tabelle 2-5.

2. Auftauen die in Tabelle 1 genannten Reagenzien 9 . Drehen Sie die Reagenzien um, um sie gründlich zu vermischen, und legen Sie sie zur späteren Verwendung auf Eis.

3. Stellen Sie die Reagenzien gemäß Tabelle zusammen 9 auf Eis.

Tisch 9 Adapterligatur ReAktionssystem

Notiz: *Der Ligation Enhancer ist viskos. Bitte durch Umdrehen oder Kippen gründlich mischen und vor Gebrauch kurz zentrifugieren.

**Die ursprüngliche Konzentration der Illumina^TM Adapter von YEASE beträgt 15 μM. Bitte verdünnen Sie den Adapter entsprechend der Eingangsmenge Und Stellen Sie das Volumen des Adapters fest auf 5 μL ein.

**Die ursprüngliche Konzentration der MGI^TM Adapter von YEASE ist 10 μM. Bitte verdünnen Sie den Adapter entsprechend der Eingangsmenge Und Stellen Sie das Volumen des Adapters fest auf 5 μL ein.

4. Durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren gründlich mischen und kurz zentrifugieren, um die gesamte Flüssigkeit von den Seiten des Röhrchens zu entfernen..

5. Inkubieren Sie die Probe in einem vorgeheizten Thermocycler wie in der Tabelle gezeigt 10 und führen Sie die Adapterverbindungsreaktion durch.

Tisch 10 Adapter-Ligation-Reaktionsprogramm

Schritt 3. Bereinigung oder Größenauswahl nach Adapterligatur

Dieser Schritt dient der Reinigung oder Größenauswahl des Produkts in Schritt 2 mit magnetischen Perlen. Durch die Reinigung können Adapterrückstände, Adapterdimere oder andere unbrauchbare Produkte entfernt werden.

CleaN von Adapter-ligierter DNA

1. Vorbereitung: Nehmen Sie den Hieff NGS^TM DNA Selection Beads aus dem Kühlschrank nehmen und mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur ausgleichen. 80%igen Ethanol frisch zubereiten.

2. Mischen Sie die Perlen gründlich durch Umdrehen oder Aufwirbeln.

3. Hinzufügen 88 μL Hieff NGS^TM DNA-Selektionsperlen (0.8×, Perlen: DNA = 0.8:1) in das Röhrchen mit dem Adapter-ligierten Produkt geben, gut schütteln und mischen und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

4. Zentrifugieren Sie kurz, um die Lösung zu erhalten, und stellen Sie das Zentrifugenröhrchen auf das Magnetgestell. Nachdem die Magnetkügelchen vollständig adsorbiert sind (ca. 5 Minuten), entfernen Sie vorsichtig die Flüssigkeit.

5. Befestigen Sie das Röhrchen auf dem Magnetständer. 200 μL frisch zubereiteten 80%igen Ethanol direkt in das Röhrchen geben. 30 Sekunden bei Raumtemperatur inkubieren und die Flüssigkeit vorsichtig entfernen.

6. Wiederholen Führen Sie erneut Schritt 5 aus.

7. Halten Sie das Röhrchen auf dem Magnetständer, öffnen Sie die Kappe und trocknen Sie die Perlen, bis sie gerade Risse aufweisen (nicht länger als 5 Minuten).

8. Nehmen Sie das Röhrchen zur Elution vom Magnetständer und eluieren die DNA

1). Wenn das Produkt nicht größenselektiv sein muss, fügen Sie 21 μL ddH hinzu₂O direkt. Gründlich mischen, indem man 10-mal auf und ab mischt oder aufwirbelt. 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Das Röhrchen kurz zentrifugieren und auf einen Magnetständer stellen. Wenn die Lösung klar ist (ca. 5 Minuten), 20 μL Überstand vorsichtig in ein neues PCR-Röhrchen überführen, ohne die Magnetkügelchen zu berühren.

2). Wenn die Produktgröße ausgewählt werden muss, fügen Sie 102 μL ddH hinzu₂O direkt. Gründlich mischen, indem man 10 Mal auf und ab wirbelt oder pipettiert. 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Das Röhrchen kurz zentrifugieren und auf einen Magnetständer stellen. Wenn die Lösung klar ist (ca. 5 Minuten), 100 μL Überstand vorsichtig in ein neues PCR-Röhrchen überführen, ohne die Magnetkügelchen zu berühren.

Notiz: Wenn das gereinigte Produkt gelagert werden muss, kann es mit TE-Puffer eluiert werden.

Größenauswahl von Adapter-ligierter DNA

1.Vorbereitung: Nehmen Sie den Hieff NGS^TM DNA Selection Beads aus dem Kühlschrank nehmen und mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur ausgleichen. 80%igen Ethanol frisch zubereiten.

2. Mischen Sie die Perlen gründlich durch Umdrehen oder Aufwirbeln.

3. Basierend auf den Zielgrößen fügen Sie die erste Runde Perlen zu den 100 μL gereinigten DNA-Vorlagen gemäß Tabelle hinzu 11. Durch 10-maliges Vortexen oder Pipettieren gründlich mischen.

Tisch 11 Empfohlene Perlen:DNA-Verhältnisse für die perlenbasierte Größenauswahl

Notiz: „ד in der Tabelle gibt das Volumen der DNA-Probe an. Wenn beispielsweise die Insertlänge der Bibliothek 250 bp beträgt und das DNA-Probenvolumen 100 μL beträgt, beträgt das Volumen der in der ersten Sortierrunde verwendeten Magnetkügelchen 0,7 × 100 μL = 70 μL; das Volumen der in der zweiten Sortierrunde verwendeten Magnetkügelchen beträgt 0,20 × 100 μL = 20 μL. Das empfohlene Kügelchenvolumen in der Tabelle gilt für die adapterligierte DNA. Wenn vor der Ligation ein Größenauswahlverfahren durchgeführt wird, beachten Sie bitte die Herstellungsprotokolle von Hieff NGS^TM DNA-Selektionsperlen (Kat.-Nr. 12601).

4. ICH5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

5. Das Röhrchen kurz zentrifugieren und auf einen Magnetständer stellen. Wenn die Lösung klar ist (ca. 5 Min.), den Überstand in ein neues PCR-Röhrchen überführen.

6. Fügen Sie der Probe aus Schritt 5 die zweite Runde Auswahlperlen hinzu gemäß Tabelle 11.Durch mindestens 10-maliges Auf- und Abpipettieren oder Vortexen gründlich mischen.

7. ICH5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

8. Zentrifugieren Sie kurz, um die Lösung zu erhalten, und stellen Sie das Zentrifugenröhrchen auf das Magnetgestell. Nachdem die Magnetkügelchen vollständig adsorbiert sind (ca. 5 Minuten), entfernen Sie vorsichtig die Flüssigkeit.

9. Befestigen Sie das Röhrchen auf dem Magnetständer. 200 μL frisch zubereiteten 80%igen Ethanol direkt in das Röhrchen geben. 30 Sekunden bei Raumtemperatur inkubieren und die Flüssigkeit vorsichtig entfernen.

10. Wiederholen Schritt 9 wieder.

11. Halten Sie das Röhrchen auf dem Magnetständer, öffnen Sie die Kappe und trocknen Sie die Perlen, bis sie gerade Risse aufweisen (nicht länger als 5 Minuten).

12. Nehmen Sie das Röhrchen zur Elution vom Magnetständer, Und direkt 21 μL ddH zugeben₂O. Durch Vortexen oder Auf- und Abpipettieren gründlich mischen und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. (Hinweis: Wenn das gereinigte Produkt gelagert werden muss, eluieren Sie es bitte in TE-Puffer.) Das Röhrchen kurz zentrifugieren und auf einen Magnetständer stellen, bis die Flüssigkeit klar wird (ca. 5 Minuten). 20 μL Überstand vorsichtig in ein neues PCR-Röhrchen überführen, ohne die Perlen zu berühren.

Schritt 4 Bibliothekserweiterung

Dieser Schritt kann die gereinigten oder größenselektierten Produkte durch PCR-Amplifikation anreichern.

1. Auftauen der Reagenzien Liste in Tabelle 12, umdrehen, gründlich mischen und zur späteren Verwendung auf Eis legen.

2. Stellen Sie die folgende Reaktion in einem sterilisierten PCR-Röhrchen zusammen.

Tisch 12 Adapterligierte DNA-PCR-Reaktion System

[Notiz]: * wenn der komplette Adapter verwendet wurde, Hieff NGS^TM Grundierungsmischung (Yeasen Katze #12190 oder Kat.-Nr. 12191) in benötigt; Wenn ein unvollständiger Adapter verwendet wird (Cat#12412~Cat#12413, Cat#12312~Katze Nr. 12315, Kat.-Nr. 13370–13371), beachten Sie bitte die Anweisungen im Kit und verwenden Sie zur Amplifikation den im Kit enthaltenen Indexprimer.

3. Durch Pipettieren oder Schütteln vorsichtig mischen und kurz zentrifugieren, um die Lösung zu erhalten.

4. Legen Sie das Röhrchen in einen Thermocycler und richten Sie das Programm gemäß Tabelle ein 13 um die Verstärkung zu starten.

Tisch 13 PCR-Amplifikationsreaktionsprogramm

Schritt 5 Aufreinigung/Größenauswahl nach der Amplifikation

Die saubere Aufwärtsschritte beziehen sich Schritt 3. Hieff NGS^TM DNA-Selektionsperlen (0,9×, Perlen:DNA=0,9:1) werden zur Reinigung des PCR-Produkts verwendet. Wenn eine Größenauswahl erforderlich ist, beachten Sie bitte Schritt 3.

Schritt 6 Qualitätskontrolle der endgültigen Bibliotheken

Die Qualität der erstellten Bibliothek wird im Allgemeinen durch Messen der Konzentration und Größenverteilung bewertet. Einzelheiten finden Sie in Hinweis 6.