Hifair™ V Multiplex One Step RT-qPCR Sondenkit (UDG Plus) ist ein Multiplex-Quantitative-PCR-Kit, das auf RNA als Vorlage basiert. Während des Experiments wurden Reverse Transkription und quantitative PCR im selben Röhrchen durchgeführt, was den Versuchsablauf vereinfachte und das Kontaminationsrisiko verringerte.

In diesem Kit wurde der Erststrang der cDNA effizient mit hitzebeständigen Hifair^TM V Reverse Transkriptase und quantitativ amplifiziert durch UNICON^TM HotStart Taq DNA Polymerase. Das Kit enthält hauptsächlich optimierten MP-Puffer, Enzymmischung usw. Die Pufferlösung enthält bereits Mg²⁺ und dNTP. Darüber hinaus werden Faktoren hinzugefügt, die die unspezifische PCR-Amplifikation wirksam hemmen und die Amplifikationseffizienz mehrerer qPCR-Reaktionen verbessern können, wodurch die Amplifikationseffizienz sichergestellt und bis zu mehrere Amplifikationsreaktionen durchgeführt werden können. Das dUTP/UDG-System wurde hinzugefügt, um das Risiko einer Aerosolkontamination wirksam zu verhindern.

Merkmale

Hohe Empfindlichkeit:Das sorgfältig optimierte Puffersystem verbessert die Nachweisempfindlichkeit von Vorlagen mit niedriger Konzentration auf bis zu 250 Kopien/ml；

Superstabilität: Das Produkt hat 18 Monate lang Echtzeit-Stabilitätstests bestanden.

dUP/UDG-Anti-Verschmutzungssystem:Das dUTP/UDG-Anti-Pollution-System wird eingeführt, um die Aerosolverschmutzung von Produkten effizient abzubauen, falsche Positivmeldungen zu reduzieren und authentische Ergebnisse sicherzustellen；

Unterstützt Schnellprogramm: Kompatibel mit Schnellprogramm, 40 Minuten können Ergebnisse liefern;

Komponenten

Notiz: 1) 2×Hifair^TM V MP-Puffer ist die Abkürzung von Hifair^TM V Multiplex One Step RT-qPCR Sondenpuffer, Dazu gehören dNTPs, dUTP, Mg2+, Stabilisatoren, Verstärker und mehr.

2) Hifair^TM V Enzymmischung enthält hauptsächlich hitzebeständiges Hifair^TM V Reverse Transkriptase, UNICONTM HotStart Taq DNA-Polymeras und UDGase.

Lagerung

TEr Produkt sollen Sei gelagert bei -25 °C bis -15 °C für 18 Monate.

Anweisungen

Reaktionszusammensetzung

Notiz:Vor Gebrauch unbedingt gut vermischen und übermäßige Blasenbildung durch heftige Vibrationen vermeiden.

a) Grundierung/Sonde Konzentration: Grundierung Mischung inklusive Multiplexprimer, je nach Situation kann die optimale Primerkonzentration zwischen 0,1 und 1,0 μM liegen.Sondenmischung einschließlich Multiplexsondenmarkierung und unterschiedlicher Fluoreszenzgruppe. Je nach Situation kann die optimale Sondenkonzentration zwischen 0,05 und 0 liegen.5 μM.

c) Verdünnung der Vorlage: qPCR ist hochempfindlich und es wird empfohlen, die Vorlage zu verdünnen. Der Kontroll-Ct-Wert liegt zwischen 20 und 35.

D) Systemvorbereitung: Kopf mit Filterelement entfernen. Kreuzkontamination und Aerosolkontamination vermeiden.

Optimiertes Fahrradprotokoll

Notiz:ein) Reverse-Transkription: Die Temperatur kann 42 wählen°C oder 50°C für 10-15 Minuten.

b) Amplifikationsreaktion: Die Temperatur wird entsprechend dem Tm-Wert der entwickelten Primer angepasst.

C) Erfassung von Fluoreszenzsignalen: Bitte stellen Sie den Versuchsablauf entsprechend den Vorgaben im Gerätehandbuch ein.

3. Anwendung Ausrüstung

Ausrüstung mit Rox:ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™

Ausrüstung mit Low Rox:ABI 7500, 7500 Fast, ViiA™7, QuantStudio™ 3 und 5, QuantStudio™ 6,7,12k Flex

Stratagene MX3000P™, MX3005P™, MX4000P™

Ausrüstung ohne Rox:

Bio-Rad CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ™5, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon® 2, Chromo4™

Eppendorf Mastercycler® ep realplex, realplex 2 s; Qiagen Corbett Rotor-Gene® Q, Rotor-Gene® 3000, Rotor-Gene® 6000

Roche Angewandte Wissenschaft LightCycler® 480, LightCycler® 2.0, Lightcycler® 96

Thermo Wissenschaftlicher PikoReal Cycler; Cepheiden SmartCycler®; Illumina Öko qPCR

Hinweise

Bitte tragen Sie die notwendige persönliche Schutzausrüstung (PSA), wie Laborkittel und Handschuhe, um Ihre Gesundheit und Sicherheit zu gewährleisten.!

Bitte verwenden Sie RNasefreie Verbrauchsmaterialien für das Experiment.

Sensibilitätstest

Die 13650, die 18 Monate lang bei -20 °C gelagert wurden (Versuchsgruppe) und die innerhalb der Haltbarkeitsdauer (Kontrollgruppe) wurden gleichzeitig auf die Gradientenverdünnung (500 Kopien/ml, 250 Kopien/ml) des Pseudovirus SARS-CoV-2 getestet, das auf das ORF-Gen und das N-Gen abzielt. Für jede Konzentration wurden acht Replikationsvertiefungen getestet, mit einer Nachweisrate von 100 %. Darüber hinaus gab es keine signifikanten Unterschiede in den Peakformen der Amplifikationskurve und den Ct-Werten.

Echtzeit-Stabilitätstest

Die 13650, die 18 Monate lang bei -20 °C gelagert wurden, und jene innerhalb ihrer Haltbarkeitsdauer. Beide Gruppen wurden gleichzeitig mit 20 Replikationsvertiefungen auf das ORF-Gen und N-Gen des SARS-CoV-2-Pseudovirus in einer Konzentration von 1000 Kopien/ml getestet. Die Nachweisrate für beide betrug 100 %, und es gab keine signifikanten Unterschiede in der Form der Amplifikationskurven oder der Ct-Werte.

Abbildung 1. RHrsg: 13650 innerhalb ihrer Haltbarkeitsdauer；Blau:13650 18 Monate bei -20°C gelagert。

Stabile Leistung nach wiederholten Frost-Tau-Zyklen

Indem das Reagenz 13650 neben normal bei -20 °C gelagerten Reagenzien 30 und 50 Gefrier-Auftau-Zyklen mit Trockeneis unterzogen und gleichzeitig auf das ORF-Gen des SARS-CoV-2-Pseudovirus getestet wurde, zeigten die Ergebnisse, dass die Leistung des Reagenz 13650 nach 50 Gefrier-Auftau-Zyklen nicht beeinträchtigt war.

Abbildung 2. Rot: 13650 normal bei -20 °C gelagert; Lila:13650 bis 30 Frost-Tau-Zyklen；Grün:13650 bis 50 Frost-Tau-Zyklen.

Kompatibel mit Standard- und Rapid-Protokollen

Mithilfe von 13650ES wurden das ORF-Gen und das N-Gen des SARS-CoV-2-Pseudovirus im selben Reaktionssystem mit Standard- und Schnellprotokollen nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigten, dass es in einem 4-fachen System keinen Unterschied in den Peakformen der Amplifikationskurve und den Ct-Werten zwischen den beiden Protokollen gab.

Unterlagen:

Benutzerhandbücher