Unspezifische Amplifikation der Taq-DNA-Polymerase ist ein häufiges Problem bei PCR-Experimenten, das die Interpretation der Nachweisergebnisse direkt beeinflusst und zu einer Verringerung der Amplifikationsempfindlichkeit und sogar zu einer Verringerung der Ausbeute des Zielfragments führen kann. Die Verwendung von Enzymmodifikatoren, um das aktive Zentrum der Taq-DNA-Polymerase bei Raumtemperatur zu versiegeln und so die DNA-Polymeraseaktivität des Taq-Enzyms bei Raumtemperatur zu hemmen, ist derzeit die effektivste Methode zur Unterdrückung unspezifischer Amplifikation. Die von Yisheng entwickelten dualen Versiegelungsantikörper versiegeln nicht nur die Polymeraseaktivität der Taq-DNA-Polymerase, sondern gleichzeitig auch die Exonukleaseaktivität der Taq-DNA-Polymerase. Dieser duale Ansatz verhindert effektiv unspezifische Amplifikation durch Fehlpaarung oder Primerdimere und verhindert auch die Entstehung unspezifischer Signale durch Materialabbau, wodurch die Spezifität des Reagenzes doppelt erhöht wird. Dadurch können Nachweisreagenzien problemlos transportiert oder bei Raumtemperatur verwendet werden.

1.Ultrahohe Amplifikationsspezifität – Der doppelt versiegelte Antikörper kann sowohl Polymerase- als auch Exonuklease-Aktivitäten gleichzeitig versiegeln, wodurch unspezifische Amplifikation wirksam vermieden und die Spezifität erhöht wird.

2.Außergewöhnliche Nachweisempfindlichkeit – Die Hot-Start-Formulierung gewährleistet eine effektive Erkennung von Genen mit geringer Häufigkeit und bietet eine höhere Empfindlichkeit.

3.Hervorragende Produktstabilität – Leistungsstabil bei Lagerung bei 37 °C für 5 Tage oder bei 4 °C für 10 Tage.

4.Basislinienstabilität und gute Linearität – Behebung des Problems der Basisliniendrift, was zu ausgezeichneter Linearität führt.

5.Schnelle Freisetzung der Enzymaktivität – Über 95 % der Enzymaktivität können durch Erhitzen auf 95 °C für 20 Sekunden freigesetzt werden.

6.Breite Anwendbarkeit von Enzymen – Geeignet sowohl für Wildtyp- als auch für mutierte Taq-Enzyme, wobei jedes mg Antikörper 4–10 KU Taq-Enzym versiegeln kann.

1 Blockierung der Taq DNA-Polymerase Exonuklease Aktivität

Synthetische Primersonden wurden jeweils in die Reaktionsmischungen der Taq-DNA-Polymerase eingearbeitet, die entweder unversiegelt oder mit Dual-Closure-Antikörpern versiegelt waren, und die Reaktionen wurden bei 40 °C durchgeführt. Die Fluoreszenzsignale beider wurden nachgewiesen, und es wurde festgestellt, dass die Dual-Closure-Antikörper die Exonuklease-Aktivität der Taq-DNA-Polymerase wirksam versiegeln können.

Abbildung 2. Nachweis der Versiegelungseffizienz der doppelt versiegelten Antikörper-Endonuklease-Aktivität.

02 Überprüfung der Erkennungsempfindlichkeit

Durch die Verwendung des doppelt versiegelten Antikörpers von Yeasen und des Antikörpers der T Company zum Versiegeln des Taq-Enzyms und die anschließende Erkennung positiver Proben mittels ARMS-PCR-Technologie wurde festgestellt, dass das durch den doppelt versiegelten Antikörper von Yeasen versiegelte Taq-Enzym bei der ARMS-PCR-Amplifikation eine höhere Empfindlichkeit aufwies.

Rot: YEASEN-Antikörper+Taq; Blau: Lieferant A Antikörper+Taq.

Abbildung 3. Amplifikationskurve der ARMS-PCR.

03 Stabilitätsüberprüfung (4 °C für 10 Tage, 37 °C für 5 Tage).

Unter Verwendung herkömmlicher geschlossener Antikörper und doppelt geschlossener Antikörper zur Blockierung der Taq-DNA-Polymerase wird die Polymerase dann in eine vollständige Vormischungslösung formuliert, die Primer und Sonden enthält. Diese Lösung wird 10 Tage lang bei 4 °C oder 1, 3 und 5 Tage lang bei 37 °C stehengelassen und dann verwendet, um 10.000 Kopien des ASF-Plasmids zu amplifizieren. Es wurde beobachtet, dass es keine signifikanten Änderungen in den Amplifikationskurven und Ct-Werten gab.

Abbildung 4. Amplifikationskurven von 10.000 Kopien des ASF-Plasmids nach Blockierung der Taq-Polymerase mit einem herkömmlichen Blockierungsantikörper (A) und einem doppelt blockierten Antikörper (B), amplifiziert durch das System der qPCR.

04 Baseline-Erkennung

Unter bestimmten Bedingungen, bei denen bestimmte Primer in Verbindung mit bestimmten Puffern und Instrumenten verwendet werden, kann ein Phänomen auftreten, das als Basisliniendrift bekannt ist. Die Verwendung von doppelt geschlossenen Antikörpern kann das Problem der Basisliniendrift jedoch wirksam lösen und so eine stabilere Basislinie ermöglichen.

Abbildung 5. Amplifikationskurven des SARS-CoV-2 N-Gens (A) und des ACT-Gens (B) in der qPCR-Analyse.

05 Linearitätsüberprüfung

Das mit doppelt verschlossenen Antikörpern versiegelte Reaktionsgemisch wurde verwendet, um 100.000, 10.000, 1.000 und 100 Kopien des ASFV/ACT-Doppelplasmids zu amplifizieren und eine Standardkurve zu erstellen. Wie aus Abbildung 7 ersichtlich, weisen beide eine gute Linearität auf.

Abbildung 6. Standardkurvendiagramme für das ASFV-Gen und das ACT-Gen, erstellt mithilfe eines Doppelblock-Reaktionsgemischs.

06 Enzymatischer Aktivitätsfreisetzungstest

Mithilfe der doppelt geschlossenen Antikörper (Cat#31303) von Yeasen zum Versiegeln des Taq-Enzyms und einem 20 Sekunden langen Thermoschock bei 95 °C wurde die enzymatische Aktivität nachgewiesen. Es ist zu beobachten, dass 31303 nach einem 20 Sekunden langen Thermoschock bei 95 °C mehr als 95 % der enzymatischen Aktivität freisetzen kann, was mit den Antikörpern der Firma T vergleichbar ist.

Tabelle 1. Hitzeschock des Enzyms bei 95 °C für 20 Sekunden.

07 Multiplex-Taq-Polymerase-Nachweis

Yeasens doppelt geschlossene Antikörper (Kat.-Nr. 31303) wurden verwendet, um drei Typen von Taq-Polymerasen (Wildtyp + zwei mutierte Typen) mit einem Versiegelungsverhältnis von 1 μg zu 5 U zu versiegeln, und die Fluoreszenzwerte und die Versiegelungseffizienz wurden gemessen. Es wurde festgestellt, dass Yeasens doppelt geschlossene Antikörper (Kat.-Nr. 31303) für verschiedene Typen von Taq-Polymerasen gute Versiegelungseffekte zeigten.

Tabelle 2. Blockierte Effizienz verschiedener Taq-Polymerasetypen.