Beschreibung
Cell Counting Kit-8 (CCK-8) ist ein schnelles und hochempfindliches Nachweiskit auf Basis des Reagenzes WST-8 (2-(2-Methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazoliummononatriumsalz). WST-8 ist ein verbessertes Reagenz von MTT und kann durch Dehydrogenasen in den Mitochondrien zu einem gut wasserlöslichen orange-gelben Formazan reduziert werden. Die Menge des erzeugten Formazans ist proportional zur Anzahl der lebenden Zellen. Der von einem Mikroplattenlesegerät erfasste OD-Wert von Formazan bei 450 nm kann indirekt die Anzahl der lebensfähigen Zellen anzeigen. Dieses Kit wird häufig für Arzneimittelscreenings, Zellproliferations- und Zytotoxizitätstests, Tests der Empfindlichkeit gegenüber Tumormedikamenten und die Aktivitätserkennung biologischer Faktoren verwendet.
Vorteile der CCK-8-Methode
1. Vergleich der CCK-8-Methode mit anderen Methoden zur Erkennung von Zellproliferation/Toxizität.
| Nachweisverfahren | MTT-Methode | XTT-Methode | WST - 1 Methode | CCK 8-Methode |
|---|---|---|---|---|
| Wasserlöslichkeit des Formazan-Produktes | Niedrig (zum Auflösen muss organisches Lösungsmittel hinzugefügt und dann getestet werden) | Hoch | Hoch | Hoch |
| Produkteigenschaften | Pulver | 2 Flaschen Lösung | Lösung | 1 Flasche Lösung |
| Anwendung | In die Lösung mischen und verwenden | Die Lösung wurde unmittelbar vor der Verwendung hergestellt. | Sofort einsatzbereit | Sofort einsatzbereit |
| Nachweisempfindlichkeit | Hoch | Sehr hoch | Sehr hoch | Hoch |
| Erkennung Zeit | Lang | Kurz | Kurz | Die kürzeste |
| Detektionswellenlänge | 560-600 nm | 420-480 nm | 420-480 nm | 430-490 nm |
| Zytotoxizität | Hohe Toxizität, vollständiges Verschwinden der Zellmorphologie | Geringe Toxizität, Zellmorphologie unverändert | Niedrig Toxizität, Zellmorphologie unverändert | Geringe Toxizität, Zellmorphologie unverändert |
| Reagenzstabilität | Allgemein | Niedrig | Allgemein | Hoch |
| Prüfung von Massenproben | Machbar | Geeignet | Geeignet | Geeignet |
2. Phenolrot und Serum beeinträchtigen die CCK-8-Erkennung nicht.
3. Da die Zytotoxizität des CCK-8-Reagenz sehr gering ist, kann der optimale Messzeitpunkt durch wiederholtes Lesen mit einem Mikroplattenlesegerät zu verschiedenen Zeitpunkten nach Zugabe des CCK-8-Reagenz ermittelt werden.
Versand und Lagerung
Das Produkt kann zwei Jahre lang bei -25–15ºC an einem trockenen und dunklen Ort gelagert werden.
Vorsichtsmaßnahmen
1. Im ersten Experiment wird empfohlen, die optimale Anzahl der plattierten Zellen und die optimale Inkubationszeit des CCK-8-Reagenz zu bestimmen.
2. Verwenden Sie nach Möglichkeit eine Mehrkanalpipette, um Abweichungen zwischen Replikationsvertiefungen zu verringern. Vermeiden Sie Blasen im Experiment, da Blasen die OD-Messung beeinträchtigen. Wenn Sie das CCK-8-Reagenz hinzufügen, wird empfohlen, es nahe an der Wand der Kulturplatte hinzuzufügen, anstatt es in das Kulturmedium einzubringen.
3. Weiße Blutkörperchen benötigen möglicherweise eine längere Inkubationszeit.
4. Bei Verwendung einer Standardplatte mit 96 Vertiefungen beträgt die Anzahl der plattierten Zellen mindestens 1.000 Zellen/Vertiefung (100 μl). Die Nachweisempfindlichkeit für weiße Blutkörperchen ist relativ gering, daher wird empfohlen, mindestens 2.500 Zellen/Vertiefung (100 μl) zu plattieren. Wenn Sie eine Platte mit 24 oder 6 Vertiefungen verwenden, berechnen Sie die entsprechende Anzahl von Zellen für jede Vertiefung und fügen Sie das entsprechende Volumen CCK-8-Reagenz hinzu (das Volumen des hinzugefügten CCK-8-Reagenz beträgt 10 % des Volumens des Kulturmediums in jeder Vertiefung der Platte).
5.Wenn der 450-nm-Filter nicht verfügbar ist, kann ein Filter mit einer Absorption zwischen 430 und 490 nm verwendet werden. Mit dem 450-nm-Filter lässt sich allerdings die höchste Nachweisempfindlichkeit erzielen.
6. Phenolrot beeinflusst die Messung nicht, da die Absorption von Phenolrot im Medium durch Subtraktion der Absorption der Blindgruppe eliminiert werden kann.
7. Tragen Sie zu Ihrer Sicherheit und Gesundheit bei der Durchführung des Experiments bitte den Laborkittel und Einweghandschuhe.
Anweisungen
I. Erstellen einer Standardkurve
1. Bereiten Sie die Zellsuspension vor, bestimmen Sie die Zelldichte und plattieren Sie dann die Zellen.
2. Verdünnen Sie die Zellen nacheinander mit dem Kulturmedium in einem bestimmten Verhältnis (z. B. im Verhältnis 1:2), um einen Zellkonzentrationsgradienten zu bilden, im Allgemeinen 3–5 Zellkonzentrationsgradienten, 3–6 Replikationsvertiefungen für jede Konzentration.
3. Nach dem Ausplattieren kultivieren Sie die Zellen 2–4 Stunden lang, damit sie haften. Fügen Sie dann das CCK-8-Reagenz hinzu, inkubieren Sie für einen bestimmten Zeitraum und messen Sie den OD-Wert. Zeichnen Sie eine Standardkurve mit der Zellzahl als X-Achse und dem OD-Wert als Y-Achse. Anhand dieser Standardkurve kann die Zellzahl in einer unbekannten Probe bestimmt werden (Voraussetzung für die Verwendung dieser Standardkurve ist, dass die Versuchsbedingungen konsistent sein müssen).
II. Zelllebensfähigkeitstest
1. Platten Sie Zellen (100 μL/Well) in einer 96-Well-Platte aus. Stellen Sie die Platte in einen Inkubator (37 °C, 5 % CO2) für einen bestimmten Zeitraum zur Vorinkubation.
2. Geben Sie 10 μL CCK-8-Reagenz in jede Vertiefung (achten Sie darauf, dass keine Luftblasen in die Vertiefungen gelangen, da diese die OD-Messung beeinträchtigen) und mischen Sie vorsichtig.
3. Legen Sie die Platte in den Inkubator und inkubieren Sie sie 1–4 Stunden lang.
4. Messen Sie die Absorption bei 450 nm mit einem Mikroplattenlesegerät.
5. Wenn der OD-Wert nicht sofort gemessen wird, geben Sie 10 μL 0,1 M HCl-Lösung oder 1 % w/v SDS-Lösung in jede Vertiefung, decken Sie die Platte ab und lagern Sie sie lichtgeschützt bei Raumtemperatur. Der Absorptionswert ändert sich innerhalb von 24 Stunden nicht.
III. Zellproliferations- und Zytotoxizitätstest
1. Platten Sie Zellen (100 μL/Well) in einer 96-Well-Platte aus. Stellen Sie die Platte in einen Inkubator (37 °C, 5 % CO2) für 24 Stunden zur Vorinkubation.
2. Geben Sie 10 μL der zu testenden Substanz in unterschiedlichen Konzentrationen auf die Platte.
3. Legen Sie die Platte in den Inkubator und inkubieren Sie sie für einen bestimmten Zeitraum (z. B. 6, 12, 24 oder 48 Stunden).
4. Geben Sie 10 μl CCK-8-Reagenz in jede Vertiefung (achten Sie darauf, dass keine Luftblasen in die Vertiefungen gelangen, da diese die OD-Messung beeinträchtigen) und mischen Sie vorsichtig.
5. Legen Sie die Platte in den Inkubator und inkubieren Sie sie 1–4 Stunden lang.
6. Messen Sie die Absorption bei 450 nm mit einem Mikroplattenlesegerät.
7. Wenn der OD-Wert nicht sofort gemessen wird, geben Sie 10 μL 0,1 M HCl-Lösung oder 1 % w/v SDS-Lösung in jede Vertiefung, decken Sie die Platte ab und lagern Sie sie lichtgeschützt bei Raumtemperatur. Der Absorptionswert ändert sich innerhalb von 24 Stunden nicht.
Notiz: Wenn die Substanz oxidierend oder reduzierend wirkt, ersetzen Sie das alte Kulturmedium durch frisches Medium (entfernen Sie das alte Medium, waschen Sie die Zellen zweimal mit frischem Medium und fügen Sie dann frisches Medium hinzu), bevor Sie das CCK-8-Reagenz hinzufügen, um die Wirkung der Substanz zu beseitigen.Wenn die Substanz selbst nur A leicht Auswirkung auf den Absorptionswert, es ist kein Austausch des Kulturmediums erforderlich und die Auswirkung der Substanz kann durch Subtraktion des Absorptionswerts einer Blindgruppe mit der Substanz eliminiert werden.
Berechnungsformel
Zellüberlebensrate = [(AC) /(BC)] x 100 %
Hemmrate = [(BA) /(BC)] x 100 %
A: Die Absorption der Versuchsgruppe (die Absorption des Kulturmediums, das Zellen, CCK-8-Reagenz und die zu testende Substanz enthält)
B: Die Absorption der Kontrollgruppe (die Absorption des Kulturmediums mit Zellen, CCK-8-Reagenz)
C: Die Absorption der Blindprobe (die Absorption des Kulturmediums, das das CCK-8-Reagenz enthält)
Zitate
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