Das Annexin V-EGFP/PI-Zellapoptose-Erkennungskit verwendet EGFP-markiertes Annexin V als Sonde, um das Auftreten einer frühen Zellapoptose zu erkennen.
Das Erkennungsprinzip ist wie folgt: In normalen lebenden Zellen befindet sich Phosphotidylserin (PS) auf der Innenseite der Zellmembran, aber in frühen apoptotischen Zellen kippt PS von der Innenseite der Zellmembran auf die Oberfläche der Zellmembran und ist der extrazellulären Umgebung ausgesetzt. Annexin-V ist ein Ca²⁺ -abhängiges Phospholipid-bindendes Protein mit einem Molekulargewicht von 35 bis 36 kDa, das mit hoher Affinität an PS bindet. Das Phosphatidylserin kann über das freiliegende Phosphatidylserin an der Außenseite der Zelle an die Membran früh apoptotischer Zellen binden.
Darüber hinaus wird Propidiumiodid (PI) bereitgestellt, um überlebende frühe Zellen von nekrotischen oder spät apoptotischen Zellen zu unterscheiden. PI ist ein Nukleinsäurefarbstoff, der die intakte Zellmembran normaler Zellen oder früh apoptotischer Zellen nicht durchdringen kann, jedoch die Zellmembran spät apoptotischer und nekrotischer Zellen durchdringen und den Zellkern rot färben kann. Wenn Annexin V mit PI kombiniert wurde, wurde PI daher aus lebenden Zellen ausgeschlossen (Annexin V^-/PI^-) und frühen apoptotischen Zellen (Annexin V⁺/PI^-). Die späten apoptotischen und nekrotischen Zellen waren doppelt positiv für EGFP und PI (Annexin V⁺/PI⁺).
Dieses Kit ist für Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie geeignet.

Produktkomponenten

Versand und Lagerung

Die Komponenten werden mit einem Eisbeutel geliefert und können ein Jahr lang bei -20 °C lichtgeschützt gelagert werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen ist zu vermeiden.
[Hinweise]: Wenn es innerhalb kurzer Zeit wiederholt verwendet werden muss, kann es ein halbes Jahr lang bei 4 °C und lichtgeschützt gelagert werden.

Vorsichtsmaßnahmen

1) Da die Apoptose ein schneller Prozess ist, wird empfohlen, die Proben innerhalb einer Stunde nach der Färbung zu analysieren.
2) Für anhaftende Zellen ist die Verdauung ein kritischer Schritt. Verwenden Sie kein EDTA in der Verdauungslösung, da EDTA die Bindung von Annexin V an PS beeinträchtigen kann.
3) Annexin V-FITC, aber nicht Annexin V-EGFP, sollte zur Fixierung von Zellen verwendet werden, um beispielsweise Apoptose und Zellzyklus gleichzeitig zu erkennen, da EGFP während der Fixierung denaturiert würde und seine Fähigkeit zur Fluoreszenzanregung verlieren würde. Die Zellen wurden vor der Fixierung mit Annexin V-FITC inkubiert und ungebundenes Annexin V-FITC wurde mit Bindungspuffer weggespült.Denn durch die erhöhte Zelldurchlässigkeit während der Fixierung entstehen Zelltrümmer, die an Annexin V binden und die Ergebnisse verfälschen können.
4) Wenn die Probe aus Blut besteht, achten Sie darauf, die Blutplättchen zu entfernen. Denn Blutplättchen enthalten PS, das an Annexin V binden und die Ergebnisse verfälschen kann. Blutplättchen können mit einem Puffermittel, das EDTA enthält, und Zentrifugieren bei 200 g weggespült werden.
5) Bitte zentrifugieren Sie das Reagenz kurz, bevor Sie den Deckel öffnen, und schütten Sie die Flüssigkeit an der Innenwand des Deckels auf den Boden des Röhrchens, um Flüssigkeitsspritzer beim Öffnen des Deckels zu vermeiden.
6) Annexin V-EGFP und PI sind lichtempfindliche Substanzen. Vermeiden Sie daher während des Betriebs Licht.
7) Nur für Forschungszwecke!

Anweisungen

Versuchsaufbau
Leeres Röhrchen: Zur Spannungsregulierung wurden negative Kontrollzellen ohne Annexin V-EGFP und PI-Färbelösung verwendet.
Einzeln gefärbte Röhrchen: Zur Modulation der Kompensation wurden positive Kontrollzellen verwendet, die nur mit Annexin V-EGFP ergänzt wurden.
Nachweisröhrchen: Die Zellen wurden mit Annexin V-EGFP und PI-Färbelösung behandelt. Die experimentellen Daten wurden durch Anpassen der Parameter des Leerröhrchens und des Einzelfarbröhrchens erhalten.
1.1 Probenfärbung
1) Suspensionszelle: Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 300 g für 5 Minuten bei 4 °C gesammelt.
anhaftende Zelle: Nach der Verdauung mit Trypsin ohne EDTA wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 300 g für 5 Minuten bei 4 °C geerntet. Die Zeit der Trypsinverdauung sollte nicht zu lang sein, um falsche positive Ergebnisse zu vermeiden.
2) Die Zellen wurden zweimal mit vorgekühltem PBS gewaschen, jedes Mal bei 300 g, und 5 Minuten lang bei 4 ℃ zentrifugiert.
3) Die Zellen wurden mit 1×Bindungspuffer resuspendiert und die Konzentration auf 1~5 ×106/ml eingestellt.
4) 100 μl Zellsuspension wurden in 5-ml-Durchflusszytometrieröhrchen gegeben, 5 μl Annexin V-EGFP wurden hinzugefügt und die Zellen wurden gemischt und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Licht inkubiert.
5) Durch Zugabe von 10 μl PI-Lösung und 400 μl PBS wurde die Färbung sofort durchgeführt.
[Hinweise]: Bei der Durchflusszytometrie zur Erkennung von Apoptose wird PI stark von der Zeit beeinflusst, und eine zu lange Zeit führt zu einer Zunahme der PI-Färbung, daher sollte die Durchflusszytometrie innerhalb von 1 Stunde abgeschlossen sein.
1.2 Durchflusszytometrieanalyse
Die maximale Anregungswellenlänge von EGFP betrug 488 nm und die maximale Emissionswellenlänge 507 nm; die maximale Anregungswellenlänge des PI-DNA-Komplexes betrug 535 nm und die maximale Emissionswellenlänge 615 nm. Für die Analyse wurde Software wie CellQuest verwendet und ein zweifarbiges Punktdiagramm erstellt, wobei EGFP die Abszisse und PI die Ordinate ist. Es wurden 10.000 Ereignisse pro Probe gesammelt. In einem typischen Experiment können die Zellen in drei Untergruppen unterteilt werden: Lebende Zellen haben nur eine sehr schwache Hintergrundfluoreszenz, frühe apoptotische Zellen haben nur eine starke grüne Fluoreszenz und späte apoptotische Zellen haben eine doppelte grüne und rote Fluoreszenzfärbung.