Das Nachweisprinzip des Annexin V-Alexa Fluor488/PI Apoptose-Nachweiskits ist wie folgt: In normalen lebenden Zellen befindet sich Phosphotidylserin (PS) auf der Innenseite der Zellmembran, aber in frühen apoptotischen Zellen kippt PS von der Innenseite der Zellmembran auf die Oberfläche der Zellmembran und ist der extrazellulären Umgebung ausgesetzt. Annexin-V ist ein Ca²⁺ -abhängiges Phospholipid-Bindungsprotein mit einem Molekulargewicht von 35 bis 36 KD, das mit hoher Affinität an PS bindet und über an der Außenseite der Zelle freiliegendes Phosphatidylserin an die Zellmembran frühapoptotischer Zellen bindet.
Darüber hinaus wird Propidiumiodid (PI) bereitgestellt, um überlebende frühe Zellen von nekrotischen oder spät apoptotischen Zellen zu unterscheiden. PI ist ein Nukleinsäurefarbstoff, der die intakte Zellmembran normaler Zellen oder früh apoptotischer Zellen nicht durchdringen kann, jedoch die Zellmembran spät apoptotischer und nekrotischer Zellen durchdringen und den Zellkern rot färben kann. Wenn Annexin V mit PI kombiniert wurde, wurde PI daher aus lebenden Zellen ausgeschlossen (Annexin V^-/PI^-) und frühen apoptotischen Zellen (Annexin V⁺/PI^-). Im Gegensatz dazu waren spätapoptotische und nekrotische Zellen doppelt positiv für Alexa Fluor488 und PI (Annexin V⁺/PI⁺).

Produktkomponenten

Versand und Lagerung

Die Komponenten werden mit einem Eisbeutel versendet und können 1 Jahr bei -20°C gelagert werden.

Vorsichtsmaßnahmen

1) Da die Apoptose ein schneller Prozess ist, wird empfohlen, die Proben innerhalb einer Stunde nach der Färbung zu analysieren.
2) Für anhaftende Zellen ist die Verdauung ein kritischer Schritt. Verwenden Sie kein EDTA in der Verdauungslösung, da EDTA die Bindung von Annexin V an PS beeinträchtigen kann.
3) Wenn die Probe aus Blut besteht, achten Sie darauf, die Blutplättchen zu entfernen. Denn Blutplättchen enthalten PS, das an Annexin V binden und die Ergebnisse verfälschen kann. Sie können ein EDTA-haltiges Puffermittel verwenden und die Blutplättchen durch Zentrifugation bei 200 g wegspülen.
4) Bitte zentrifugieren Sie das Reagenz kurz, bevor Sie den Deckel öffnen, und schütten Sie die Flüssigkeit an der Innenwand des Deckels auf den Boden des Röhrchens, um Flüssigkeitsspritzer beim Öffnen des Deckels zu vermeiden.
5) Annexin V-Alexa Fluor488 und PI sind lichtempfindliche Substanzen und sollten bei der Handhabung vor Licht geschützt werden.
6) Nur für Forschungszwecke!

Anweisungen

1.1 Probefärbung
1.a) Suspensionszelle: Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 300 g für 5 Minuten bei 4 °C gesammelt.
b) anhaftende Zelle: Nach der Verdauung mit Trypsin ohne EDTA wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 300 g für 5 min bei 4 °C geerntet. Die Trypsinverdauungszeit sollte nicht zu lang sein, um falsche positive Ergebnisse zu vermeiden.
2. Die Zellen wurden zweimal mit auf 4 °C vorgekühltem PBS gewaschen, jedes Mal mit 300 g, und 5 Minuten lang bei 4 °C zentrifugiert.
3. Die Zellen wurden durch Zugabe von 250 μl 1×Bindungspuffer resuspendiert und die Konzentration auf 1×106/ml eingestellt.
4. 100 μl Zellsuspension wurden in ein 5-ml-Durchflusszytometrieröhrchen gegeben, 5 μl Annexin V-Alexa Fluor 488 und 10 μl PI wurden hinzugefügt und vorsichtig gemischt.
5. Die Reaktion wurde lichtgeschützt und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur aufbewahrt.
6. 400 μl 1×Bindungspuffer wurden hinzugefügt, gemischt und die Proben wurden innerhalb von 1 Stunde per Durchflusszytometrie erkannt.
[Hinweise]: Um einen Zellverlust während der Zellwäsche zu vermeiden, kann eine kleine Spitze zum Absaugen der Flüssigkeit verwendet werden.
1.2 Durchflusszytometrieanalyse
Alexa Fluor488 hat eine maximale Anregungswellenlänge von 488 nm und eine maximale Emissionswellenlänge von 519 nm; die maximale Anregungswellenlänge des PI-DNA-Komplexes betrug 535 nm und die maximale Emissionswellenlänge 615 nm. CellQuest und andere Software wurden zur Analyse verwendet und ein zweifarbiges Punktdiagramm mit Alexa Fluor488 als Abszisse und PI als Ordinate gezeichnet. Erfassen Sie 10.000 Ereignisse pro Probe.
1.3 Fluoreszenzmikroskopische Analyse
1) Geben Sie einen Tropfen der mit Annexin V-FITC/PI doppelt gefärbten Zellsuspension auf den Objektträger und decken Sie die Zellen mit einem Deckglas ab.
2) Es wurde unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem Zweifarbenfilter beobachtet. Das Annexin V-FITC-Fluoreszenzsignal war grün und das PI-Fluoreszenzsignal war rot.