Wenn Zellen Apoptose durchlaufen, aktivieren sie Endonuklease-Enzyme, die die genomische DNA zwischen Nukleosomen schneiden. Nachdem DNA während der Apoptose extrahiert wurde, konnte eine 180-200 bp lange DNA-Leiter gefunden werden.
Mit dem TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling) Apoptose-Nachweiskit (Alexa Fluor 640) kann die Fragmentierung der nukleären DNA im späten apoptotischen Prozess von Gewebezellen nachgewiesen werden. Das Prinzip besteht darin, dass Alexa Fluor 640-12-DUTP unter der Einwirkung der terminalen Desoxynukleotidyltransferase (TdT) in das 3´-Hydroxyl-(3´-OH)-Terminus eingebaut wird, das während des Bruchs der genomischen DNA freigelegt wird. Daher kann es mittels Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrie nachgewiesen werden. Alexa Fluor 640 ist ein roter Fluoreszenzfarbstoff mit hoher Stabilität und starker Helligkeit.
Dieses Kit hat ein breites Anwendungsspektrum und kann zum Nachweis von Apoptose in gefrorenen oder Paraffinschnitten sowie in kultivierten anhaftenden oder suspendierten Zellen verwendet werden.

Produktkomponenten

Versand und Lagerung

Die Komponenten werden mit einem Eisbeutel versendet und können 1 Jahr bei -20°C gelagert werden.

Vorsichtsmaßnahmen

1. Sie müssen Ihr eigenes PBS zum Waschen der Zellen, eine Anti-Fluoreszenzlöschlösung zum Versiegeln der Tabletten und 4 % Paraformaldehyd zum Fixieren vorbereiten. Leukozyten müssen möglicherweise über einen langen Zeitraum kultiviert werden.
2. Nur für Forschungszwecke!

Anweisungen

1. Die Probenvorbereitung
1.1 In Paraffin eingebettete Gewebeschnitte
1.1.1. Die Paraffingewebeschnitte wurden 5 Minuten lang bei Raumtemperatur in Xylol getaucht und dieser Vorgang wurde einmal wiederholt, um das Paraffin gründlich zu entfernen.
1.1.2.Weichen Sie die Abschnitte 5 Minuten lang bei Raumtemperatur in 100 % Ethanol ein und wiederholen Sie den Vorgang einmal.
1.1.3. Bei Raumtemperatur wurden die Proben jeweils 3 Minuten lang in Gradientenethanol (90, 80, 70 %) getränkt.
1.1.4.Spülen Sie die Abschnitte vorsichtig mit PBS ab und tupfen Sie die überschüssige Flüssigkeit um die Probe auf den Objektträgern vorsichtig mit Filterpapier ab. In diesem Fall kann der Paraffinstift oder der hydrophobe Stift verwendet werden, um den Umriss der Probenverteilung um die Probe herum zu zeichnen, was für die nachfolgende Permeabilitätsverarbeitung und den Ausgleichsbeschriftungsvorgang praktisch ist. Lassen Sie die Probe während des Experiments nicht trocknen. Legen Sie die verarbeitete Probe in die Nassbox, um die Probe feucht zu halten.
1.1.5.2 mg/ml Proteinase K-Lösung wurde im Verhältnis 1:100 mit PBS verdünnt, um eine Endkonzentration von 20 μg/ml zu erreichen.
1.1.6.100 μl Proteinase-K-Lösung mit einer Konzentration von 20 μg/ml wurden zu jeder Probe hinzugefügt, um sie vollständig zu bedecken, und 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
[Hinweise]: Proteinase K hilft Geweben und Zellen, in nachfolgenden Schritten für die Färbereagenzien durchlässig zu werden. Eine zu lange Inkubationszeit erhöht das Risiko, dass Gewebeschnitte in nachfolgenden Waschschritten von der Trägerplatte abfallen, während eine zu kurze Inkubationszeit zu einer unzureichenden Permeabilitätsbehandlung führen und die Markierungseffizienz beeinträchtigen kann. Um bessere Ergebnisse zu erzielen, kann es notwendig sein, die Inkubationszeit von Proteinase K zu optimieren.
1.1.7.Spülen Sie die Probe 2-3 Mal mit PBS-Lösung, entfernen Sie vorsichtig überschüssige Flüssigkeit und tupfen Sie die Flüssigkeit rund um die Probe auf dem Objektträger vorsichtig mit Filterpapier ab. Die verarbeitete Probe wird in eine Nassbox gelegt, um die Probe feucht zu halten.
1.2 Gefrierschnitt
1.2.1. Gefrorene Schnitte entnehmen und auf Zimmertemperatur bringen. Die Objektträger wurden in eine 4%ige Paraformaldehydlösung (gelöst in PBS) getaucht, fixiert und 30 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert.
1.2.2. Entfernen Sie vorsichtig überschüssige Flüssigkeit und tupfen Sie die überschüssige Flüssigkeit rund um die Probe auf dem Objektträger mit Filterpapier vorsichtig ab.
1.2.3. Die Objektträger wurden in eine PBS-Lösung getaucht, 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und insgesamt noch zweimal mit PBS gewaschen.
1.2.4. Entfernen Sie vorsichtig überschüssige Flüssigkeit und tupfen Sie den Objektträger vorsichtig mit Filterpapier ab, um überschüssige Flüssigkeit um die Probe herum zu entfernen. In diesem Fall kann der Paraffinstift oder der hydrophobe Stift verwendet werden, um den Umriss der Probenverteilung um die Probe herum zu zeichnen, was für die nachfolgende Permeabilitätsverarbeitung und den Ausgleichsbeschriftungsvorgang praktisch ist. Lassen Sie die Probe während des Experiments nicht trocknen und legen Sie die verarbeitete Probe in die Nassbox, um die Probe feucht zu halten.
1.2.5. 2 mg/ml Proteinase K-Lösung wurde im Verhältnis 1:100 mit PBS verdünnt, um eine Endkonzentration von 20 μg/ml zu erreichen.
1.2.6. Zu jeder Probe wurden 100 μl Proteinase-K-Lösung mit einer Konzentration von 20 μg/ml hinzugefügt, um sie vollständig zu bedecken, und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
[Hinweise]: Proteinase K hilft Gewebe und Zellen, in nachfolgenden Schritten für Färbereagenzien durchlässig zu sein. Eine zu lange Inkubationszeit erhöht das Risiko, dass Gewebeschnitte in nachfolgenden Waschschritten von der Trägerplatte abfallen, während eine zu kurze Inkubationszeit zu einer unzureichenden Permeabilitätsbehandlung führen und die Markierungseffizienz beeinträchtigen kann. Wenn keine besseren Ergebnisse erzielt wurden, kann es erforderlich sein, die Inkubationszeit von Proteinase K zu optimieren.
1.2.7. Spülen Sie die Probe 2–3 Mal in einem offenen Becher mit PBS-Lösung.
[Hinweise]: Um beim Reinigen den Verlust der Probenschale zu vermeiden, wird empfohlen, die Flasche nicht zu waschen, sondern die Objektträger zum Reinigen 2-3 Mal in einer PBS-Lösung einzuweichen.
1.2.8. Entfernen Sie vorsichtig überschüssige Flüssigkeit und tupfen Sie die Flüssigkeit rund um die Probe auf dem Objektträger mit Filterpapier vorsichtig ab.Die verarbeitete Probe wird in eine Nassbox gelegt, um die Feuchtigkeit der Probe zu bewahren.
1.3 Vorbereitung des Zellkriechblattes
Adhärente Zellen wurden auf Lab-Tek Chamber Slides kultiviert. Nach der Apoptose-Induktionsbehandlung wurden die Objektträger zweimal mit PBS gewaschen.
1.4 Herstellung von Zellausstrichen (am Beispiel von mit Polylysin beschichteten Objektträgern)
1.4.1. Die Zellen wurden in PBS bei einer Konzentration von etwa 2 × 107 Zellen/ml resuspendiert, 50–100 μl der Zellsuspension wurden auf mit Polylysin beschichtete Objektträger aufgesaugt und die Zellsuspension wurde vorsichtig mit einem sauberen Objektträger ausgebreitet.
1.4.2. Die Zellen wurden fixiert und die Objektträger in einen Färbebehälter mit 4 % frisch hergestelltem Paraformaldehyd in PBS getaucht und 25 Minuten lang bei 4 °C aufbewahrt.
1.4.3. Die Objektträger wurden gewaschen, in PBS getaucht und 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nochmals mit PBS waschen.
1.4.4. Entfernen Sie vorsichtig überschüssige Flüssigkeit und tupfen Sie den Objektträger vorsichtig mit Filterpapier ab, um überschüssige Flüssigkeit um die Probe herum zu entfernen. In diesem Fall kann ein Paraffinstift oder ein hydrophober Stift verwendet werden, um die Verteilung der Probe um die Probe herum zu skizzieren, um die nachfolgende Permeabilitätsverarbeitung und die Bilanzkennzeichnungsvorgänge zu erleichtern. Lassen Sie die Probe während des Experiments nicht trocknen und legen Sie die verarbeitete Probe in die Nassbox, um die Probe feucht zu halten.
1.4.5. 2 mg/ml Proteinase K-Lösung wurde im Verhältnis 1:100 mit PBS verdünnt, um eine Endkonzentration von 20 μg/ml zu erreichen.
1.4.6. Zu jeder Probe wurden 100 μl Proteinase-K-Lösung mit einer Konzentration von 20 μg/ml hinzugefügt, um sie vollständig zu bedecken, und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert (zur Permeabilitätsbehandlung kann sie auch in eine 0,2 %ige Triton-X-100-Lösung in PBS getaucht und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert werden).
[Hinweise]: Proteinase K hilft Gewebe und Zellen, in nachfolgenden Schritten für Färbereagenzien durchlässig zu sein. Eine zu lange Inkubationszeit erhöht das Risiko, dass Gewebeschnitte in nachfolgenden Waschschritten von der Trägerplatte abfallen, während eine zu kurze Inkubationszeit zu einer unzureichenden Permeabilitätsbehandlung führen und die Markierungseffizienz beeinträchtigen kann. Wenn keine besseren Ergebnisse erzielt wurden, kann es erforderlich sein, die Inkubationszeit von Proteinase K zu optimieren.
1.4.7. Spülen Sie die Probe 2-3 Mal mit PBS, entfernen Sie vorsichtig überschüssige Flüssigkeit und tupfen Sie die Flüssigkeit um die Probe herum auf dem Objektträger vorsichtig mit Filterpapier ab. Die verarbeiteten Proben wurden in eine Nassbox gelegt.
2. Schritte zur DNase-Behandlung positiver Kontrollen
Nach der Probenpermeation Zellen wurden mit DNase I behandelt, um positive Kontrollobjektträger herzustellen. Dieser Prozess führt normalerweise dazu, dass die meisten Zellen behandelt, um grüne Fluoreszenz zu zeigen.
[Anmerkungen]: Die Behandlung immobilisierter Zellen mit DNase I führt zum Bruch der chromosomalen DNA, wodurch viele 3'-Enden der DNA entstehen, die markiert werden können.
2.1.10×DNase I-Puffer mit deionisiertem Wasser im Verhältnis 1:10 verdünnen (für jede Probe werden 200 µl 1× DNase I-Puffer benötigt, d. h. zur Verdünnung werden 20 µl 10× DNase I-Puffer und 180 µl deionisiertes Wasser benötigt). Ein Tropfen von 100 µl wurde der durchlässigen Probe hinzugefügt und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. 1 µl DNase I (1U/µl) zu den verbleibenden 100 µl 1×DNase I-Puffer hinzufügen, um eine Endkonzentration von 10 U/ml zu erreichen.
2.2. Die Flüssigkeit wurde vorsichtig abgeklopft, dann wurden 100 μl Puffer mit 10 U/ml DNase I hinzugefügt und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
2.3. Klopfen Sie den Objektträger ab, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und waschen Sie den Objektträger drei- bis viermal gründlich in einem Farbtank mit deionisiertem Wasser.
[Hinweise]: Für die positiven Kontrollobjektträger muss ein separates Färbebecken verwendet werden. Andernfalls kann Rest-DNase I auf den positiven Kontrollobjektträgern zu einem hohen Hintergrund auf den Versuchsobjektträgern führen.
3. Markierung und Nachweis
3.1.Äquilibrierungspuffer (5 x Äquilibrierungspuffer) wird mit deionisiertem Wasser im Verhältnis 1:5 verdünnt (pro Probe werden 100 μL 1 x Äquilibrierungspuffer benötigt).
3.2. Jeder Probe wurde Äquilibrierungspuffer (100 μl 1×Äquilibrierungspuffer) hinzugefügt, um die Fläche vollständig auszugleichen, und 10–30 Minuten bei RT inkubiert. Alternativ können Sie die Probe in ein Gefäß mit 1 x Äquilibrierungspuffer schieben, um sicherzustellen, dass die Objektträger die Probe nicht ausgleichen. Tauen Sie die Alexa Fluor 640-12-dUTP-Markierungsmischung auf Eis auf, während Sie die Zellen ausbalancieren, und bereiten Sie gemäß Tabelle 1 genügend TdT-Inkubationspuffer für alle Experimente und optionalen positiven Kontrollreaktionen vor. Für eine Standardreaktion mit einer Fläche von weniger als 5 cm2 beträgt das Volumen 50 μl, und 50 μl werden mit der Anzahl der experimentellen und positiven Kontrollreaktionen multipliziert, um das Gesamtvolumen des erforderlichen TdT-Inkubationspuffers zu bestimmen. Bei Proben mit größeren Oberflächen kann das Reagenzvolumen proportional erhöht werden.

Tabelle 1. Für Experimente vorbereitete TdT-Inkubationspuffer und optionale positive Kontrollreaktionen

[Negatives Kontrollsystem]: Es wurde ein Kontrollinkubationspuffer ohne das TdT-Enzym hergestellt und das TdT-Enzym durch ddH2O ersetzt.
3.3. Der Großteil der 100 μL 1× Äquilibrierungspufferlösung wurde mit saugfähigem Papier um den äquilibrierten Bereich herum abgewaschen und dann wurden 50 μLTdT-Inkubationspuffer zu einem 5 cm2 großen Zellbereich hinzugefügt. Die Zellen dürfen nicht austrocknen. Danach sollte der Objektträger vor Licht geschützt werden.
3.4. Legen Sie einen Plastikdeckglasträger über die Zellen, um eine gleichmäßige Verteilung der Reagenzien zu gewährleisten, und legen Sie ein mit Wasser angefeuchtetes Papiertuch auf den Boden der Nassbox. Die Objektträger wurden in eine Nassbox gelegt und 60 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Wickeln Sie die Nassbox in Aluminiumfolie ein, um sie vor Licht zu schützen.
[Hinweise]: Das Kunststoff-Abdeckglas kann vor der Verwendung halbiert werden. Falten Sie den Rand des Deckglases, um es leichter entfernen und handhaben zu können.
3.5. Die Plastikdeckgläser wurden entfernt und die Schnitte 5 Minuten lang bei Raumtemperatur in PBS-Lösung inkubiert. Anschließend wurden die Schnitte zweimal mit frischem PBS gewaschen.
3.6. Wischen Sie die PBS-Lösung vorsichtig mit Filterpapier um und auf der Rückseite der Probe ab.
[Hinweise]: Um den Hintergrund zu reduzieren, können die Objektträger nach einmaligem Waschen mit PBS dreimal für jeweils 5 Minuten mit PBS mit 0,1 % Triton X-100 und 5 mg/ml BSA gewaschen werden, damit die freien, nicht umgesetzten Markierungen klar und sauber werden.
3.7. Die Proben wurden in einem Färbebehälter gefärbt, und die Objektträger wurden im Dunkeln in einen Färbebehälter mit PI-Lösung (1 μg/ml, frisch zubereitet und mit PBS verdünnt) eingetaucht und 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. (Optional): Die Proben wurden in einem Färbebehälter gefärbt, und die Objektträger wurden im Dunkeln in einen Färbebehälter mit DAPI-Lösung (2 μg/ml, frisch zubereitet und mit PBS verdünnt) eingetaucht und 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen.
3.8.Waschen Sie die Probe, tauchen Sie den Objektträger in deionisiertes Wasser und lassen Sie ihn 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Wiederholen Sie den Vorgang zweimal, sodass Sie insgesamt drei Waschvorgänge durchführen können.
3.9. Das überschüssige Wasser auf dem Objektträger wurde abgeklopft und 100 μl PBS wurden zum Probenbereich hinzugefügt, um die Probe feucht zu halten.
3.10. Die Proben wurden sofort unter einem Fluoreszenzmikroskop analysiert. Die rote Fluoreszenz von Alexa Fluor 640 wurde bei 620 nm nachgewiesen und blaues DAPI wurde bei 460 nm beobachtet. DAPI konnte sowohl apoptotische als auch nicht-apoptotische Zellen blau färben, und nur in apoptotischen Kernen wurde Alexa Fluor 640-12-dUTP eingebaut und lokalisierte rote Fluoreszenz. Bei Bedarf können die Objektträger über Nacht bei 4 °C im Dunkeln gelagert werden.
4. Die Suspensionszellen wurden mittels Durchflusszytometrie nachgewiesen
4.1. 3–5 × 106 Zellen wurden zweimal durch Zentrifugation (300 × g) bei 4 °C mit PBS gewaschen, 10 Minuten lang bei 4 °C bei 300 g zentrifugiert und dann in 0,5 ml PBS resuspendiert.
4.2. Die Zellen wurden fixiert, mit 5 ml einer 1%igen Paraformaldehydlösung in PBS versetzt und 20 Minuten lang auf Eis gelegt.
4.3. Die Zellen wurden 10 Minuten lang bei 4 °C bei 300 × g zentrifugiert, der Überstand wurde entfernt und in 5 ml PBS resuspendiert. Der Waschvorgang wurde einmal wiederholt und die Zellen wurden mit 0,5 ml PBS resuspendiert.
4.4. Die Zellen wurden permeiert, und 5 ml eisgekühlter 70%iger Ethanol wurden hinzugefügt und 4 Stunden lang bei -20 °C inkubiert. Die Zellen konnten eine Woche lang bei -20 °C in 70%igem Ethanol gelagert werden, oder die Zellen konnten mit einer 0,2%igen Triton X-100-Lösung, die in PBS hergestellt und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur gelagert wurde, permeiert werden.
4.5. Die Zellen wurden 10 Minuten lang bei 300 × g zentrifugiert und in 5 ml PBS resuspendiert. Die Zentrifugation wurde wiederholt und die Zellen wurden in 1 ml PBS resuspendiert.
4.6. Übertragen Sie 2 × 106 Zellen in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
4.7. Zur Äquilibrierung wurde 10 Minuten lang bei 300 × g zentrifugiert, der Überstand entfernt und mit 80 μl 1 × Äquilibrierungspuffer resuspendiert. 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.
4.8. Während des Zellausgleichs wurde Alexa Fluor 640-12-dUTP Labeling Mix auf Eis geschmolzen und eine ausreichende Menge TdT-Inkubationspuffer für alle Reaktionen gemäß Tabelle 1 hergestellt. Für eine Standardreaktion von 2 × 106 Zellen betrug das Volumen 50 μl und 50 μl wurden mit der Anzahl der Reaktionen multipliziert, um das erforderliche Gesamtvolumen des TdT-Inkubationspuffers zu bestimmen.
4.9. Die Zellen wurden 10 Minuten lang bei 300 × g zentrifugiert, der Überstand entfernt und der Niederschlag in 50 μl TdT-Inkubationspuffer resuspendiert und 60 Minuten lang bei 37 °C lichtgeschützt inkubiert. Die Zellen wurden alle 15 Minuten vorsichtig mit einer Mikropipette resuspendiert.
4.10. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 ml 20 mM EDTA und vorsichtiges Mischen mit einer Mikropipette beendet.
4.11. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 300 g wurde der Überstand verworfen und der Niederschlag in 1 ml 0,1 % Triton X-100-Lösung in PBS, die 5 mg/ml BSA enthielt, resuspendiert. Die Lösung wurde einmal wiederholt und insgesamt zweimal gewaschen.
4.12. Die Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert und die rote Fluoreszenz von Alexa Fluor 640 bei 620 nm gemessen.