Beschreibung
Das MycAway™ Mycoplasma qPCR Detection Kit ist ein Produkt, das für den qualitativen Nachweis von Mycoplasma-Kontaminationen in verschiedenen Quellen entwickelt wurde, darunter Rohstoffe, Zellbanken, Virussamen, Lösungen zur Virus- oder Zellernte und Zellen, die in klinischen Behandlungen verwendet werden. Dieses Kit verwendet Taqman-Fluoreszenzsonden (FAM und VIC) und verwendet Techniken der multiplen Polymerase-Kettenreaktion (PCR), um das Ziel und die interne Kontrolle getrennt zu erkennen. Es wurde gemäß EP <2.6.7>-Standards auf Spezifität, Nachweisgrenze und Robustheit validiert und weist eine hohe Sensitivität, Spezifität, Effizienz und Sicherheit auf. Die Nachweisgrenze liegt bei oder unter 10 KBE/ml.
Zur Extraktion von Nukleinsäure kann dieses Produkt in Verbindung mit dem MolPure® Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit (Kat.-Nr. 18461) verwendet werden, das manuelle Extraktionsmethoden verwendet. Alternativ können Nukleinsäuren in Proben automatisch mit dem automatischen Nukleinsäureextraktor AutoPure 32A (Kat.-Nr. 80501) und dem MolPure® Mag32 Residual DNA Sample Preparation Kit FA (Kat.-Nr. 18462) extrahiert werden. Es ist wichtig zu beachten, dass Kits mit den Kat.-Nr. 18461 und 40619 einer umfassenden Validierung unterzogen wurden. Detaillierte Validierungsinformationen erhalten Sie von unserem technischen Support. Nach der Vorbehandlung der Proben zur Entfernung störender Verunreinigungen und dem Erhalt gereinigter Nukleinsäuren wird eine qPCR-Reaktion mit einem Echtzeit-PCR-Verstärker durchgeführt und das Fluoreszenzsignal der Sonde gesammelt und analysiert.
| Kat.-Nr. | 40619ES25 / 40619ES60 |
| Größe | 25 T / 100 T |
| Erkennung Limit | 10 KBE/ml |
| Erkennen Verfahren | qPCR Verfahren (Taqman fluoreszierend) |
| Dauer | 4 Std. |
| Fluoreszierend Sonde | FAM (Ziel Kanal); VIC (Intern Kanal) |
| Bedeckt Mykoplasmen | ≥ 100 |
| Validierung | Validiert nach Zu EP <2.6.7> |
Komponenten
| Komponenten Nr. | Name | 40619ES25 | 40619ES60 |
| 40619-A | 4×MyqPCR-Reaktionspuffer | 250 μL | 1 ml |
| 40619-B | MyPrimer & Probe MISCHEN | 25 μL | 100 μL |
| 40619-C* | Interne Kontrolle (IC) | 25 μL | 100 μL |
| 40619-D** | Positive Kontrolle (PC) | 500 μL | 2 ml |
| 40619-E*** | DNA-Verdünnung Puffer | 1 ml | 4×1 ml |
| 40619-F**** | Reinstwasser | 500 μL | 2×1 ml |
*IC: Intern Kontrolle;
**PCS: Positiv Kontrolle Lösung ,Die Konzentration Ist 1.000 Kopien/µl.
***DNA Verdünnung Puffer: gebraucht für IC Verdünnung Und Die Vorlage von NTC Und NCS.
****Hochrein Wasser: gebraucht für Die Vorbereitung von qPCR Mischen.
Lagerung
Dieses Produkt sollte 2 Jahre lang bei -25–15 °C gelagert werden.
*Überprüfen Sie nach Erhalt des Kits, ob alle Komponenten vollständig sind, und lagern Sie sie sofort bei -25 bis -15 °C. Zustand, andernfalls führen Sie den Test sofort durch. Bitte beachten Sie, dass 40619-B lichtgeschützt gelagert werden muss.
Anweisungen
- Vorbereitungen vor dem Experiment
1) Bereiten Sie die erforderlichen Reagenzien und Materialien vor, die im Experiment verwendet werden.
2) Bestätigen Sie die Eignung von das qPCR-Instrument
Dieses Kit kann mit den folgenden qPCR-Instrumenttypen verwendet werden:
- Bio-Rad: CFX96
- Thermo Scientific: 7500 Echtzeit-PCR-System; QuantStudio™5;
- Versuchsmethode
1) DNA-Extraktion
Wir empfehlen die Verwendung ' Magnetisches DNA-Restprobenvorbereitungskit' (Kat.-Nr. 18461ES für manuelle Extraktion und Cat#18462ES für automatische Extraktion) für die DNA-Extraktion, Du dürfen besuchen ' http:/www.yeasenbiotech.com ' für Die
detaillierte Informationen und den Einkauf.
Das Kit (Cat#40619ES) enthält eine interne Kontrolle (IC). Wenn Sie die IC vor der DNA-Extraktion zu den Proben hinzufügen, können Sie den gesamten Prozess (einschließlich DNA-Extraktion und qPCR-Reaktion) überprüfen. Wenn Sie die IC zum qPCR-Mastermix hinzufügen
direkt, Der IC fungiert nur als qPCR-Kontrolle.
2）Vorbereitung des qPCR-Mix
- Je nach Probenmenge, die Positive Kontrolle (PCS), No Template Control (NTC), Negative Kontrolllösung (NCS) und Testprobe (TS), um die Anzahl der Reaktionen zu berechnen. Bereiten Sie 2 Reaktionen parallel vor für
jede Probe im Allgemeinen.
* PCS: Positiv Kontrolle Lösung; NTC: Nein Vorlage Kontrolle; NCS: Negativ Kontrolle Lösung; TS: Test Probe. Es Ist NEIN brauchen Zu durchführen
Die Probe Extraktion für PCS Und NTC, aber NCS Und TS Sind erforderlich.
Reaktionskammern (M1) = (1 × NCS + N×TS） ×2
Reaktionskammern (M2) = (1 × PCS + 1 × NTC) ×2
Reaktionskammern (M3) = (1 × PCS + 1 × NTC + N × TS) ×2
- Tauen Sie die erforderliche Menge Reagenzien entsprechend dem Versuchsplan und den Tabellen unten auf Eis vor.
- Berechnen Sie die Menge des qPCR-Mixes entsprechend der Anzahl der Reaktionen. Bitte beachten Sie: Wenn das Kit für GMP-Aktivitäten wie die Produktfreigabe verwendet wird, empfehlen wir die Verwendung der Tabellen 1 und 2 für die Vorbereitung. Wenn Das Kit wird Nur für die Forschung verwendet und es besteht keine Notwendigkeit, IC vor der Extraktion nach der Auswertung hinzuzufügen, dann folgen Sie Tabelle 3 für
die Vorbereitung. Bitte beachten Sie, dass nicht alle M1, M2 und M3 Sind musste Sei vorbereiten.
| Komponente | Volumen (1 × 40 μL Reaktionen) | Volumen (M1 × 40 μL) |
| 4× MyqPCR-Reaktionspuffer | 10 μL | (M1+2) ×10 μL |
| MyPrimer & Probe MISCHEN | 1 μL | (M1+2) ×1 μL |
| ROX | 0,8 μL /0 µl** | (M1+2) ×0,8 μL /0 μL |
| Gereinigtes Wasser | Bis zu 20 μL | Bis zu (M1+2) ×20 μL |
| Gesamt | 20 μL | (M1+2) ×20 μL |
Tabelle 1 qPCR-Mix-System für M1
*Der Konfiguration System In Tisch 1 ist basierend An Die Prämisse Das IC Ist hinzugefügt vor Extraktion für beide NCS Und TS, also Es Ist nicht notwendig
Zu hinzufügen IC Wann qPCR Mischen Vorbereitung. IC Hinzufügen Verfahren vor Extraktion: Erstens verdünnen IC von 20 mal mit DNA Verdünnungsmittel und hinzufügen 1 μl
verdünnt IC hinein jede 100 μl prüfen Probe für Die weiter Extraktion.
**Das Bausatz tut nicht enthalten ROX Referenz Farbstoff. Wenn ROX Referenz Farbstoff Ist nötig für Die Real Zeit PCR Verstärker Das Du Sind momentan verwenden, 50×ROX Referenz Farbstoff (Cat#10200ES) ist empfohlen für verwenden. In Das Fall, die hinzugefügt Volumen Ist 0,8 μl, als gezeigt In Tisch 1. Wenn mit andere
Marken von ROX Produkte, bitte verweisen Zu ihre Anweisungen für ROX Zusatz.Wenn NEIN ROX Referenz Farbstoff Ist erforderlich, die hinzugefügt Volumen Ist 0 μL.
| Komponente | Volumen (1 × 40 μL Reaktionen) | Volumen (M2 × 40 μL) |
| 4× MyqPCR-Reaktionspuffer | 10 μL | (M2+2) ×10 μL |
| MyPrimer & Probe MISCHEN | 1 μL | (M2+2) ×1 μL |
| Interne Kontrolle (IC) | 1 μL* | (M2+2) ×1 μL /0 μL |
| ROX | 0,8 μL /0 µl** | (M2+2) ×0,8 μL /0 μL |
| Gereinigt Wasser | Bis zu 20 μL | Bis zu (M2+2) ×20 μL |
| Gesamt | 20 μL | (M2+2) ×20 μL |
Tabelle 2 qPCR Mix-System für M2
*Der Konfiguration System In Tisch 2 Ist basierend An Die Prämisse Das IC Ist nicht hinzugefügt In PCS Und NTC vor Extraktion, Also IC Bedürfnisse Zu Sei hinzugefügt während qPCR Mischen Vorbereitung. IC Hinzufügen Verfahren nach Extraktion: Verdünnen IC von 100 mal mit DNA Verdünnungsmittel Und hinzufügen 1 μl verdünnt IC hinein
jede qPCR Mischen System.
**Das Bausatz tut nicht enthalten ROX Referenz Farbstoff. Wenn ROX Referenz Farbstoff Ist nötig für Die Real Zeit PCR Verstärker Das Du Sind momentan verwenden, 50×ROX Referenz Farbstoff (Cat#10200ES) ist empfohlen für verwenden. In Das Fall, die hinzugefügt Volumen Ist 0,8 μl, als gezeigt In Tisch 1. Wenn mit andere
Marken von ROX Produkte, bitte verweisen Zu ihre Anweisungen für ROX zusätzlich. Wenn NEIN ROX Referenz Farbstoff Ist erforderlich, die hinzugefügt Volumen Ist 0 μL.
| Komponente | Volumen (1 × 40 μL Reaktionen) | Volumen (M3 × 40 μL) |
| 4× MyqPCR-Reaktionspuffer | 10 μL | (M3+2) ×10 μL |
| MyPrimer & Probe MISCHEN | 1 μL | (M3+2) ×1 μL |
| Interne Kontrolle (IC) | 1 μL* | (M3+2) ×1 μL /0 μL |
| ROX | 0,8 μL /0 µL** | (M3+2) ×0,8 μL /0 μL |
| Gereinigt Wasser | Bis zu 20 μL | Bis zu (M3+2) ×20 μL |
| Gesamt | 20 μL | (M3+2) ×20 μL |
Tabelle 3 qPCR Mix-System für M3
*Der Konfiguration System In Tisch 3 ist basierend An Die Prämisse Das IC Ist nicht hinzugefügt Zu Proben vor Extraktion, also IC Bedürfnisse Zu Sei hinzugefügt während qPCR Mischen Vorbereitung. IC Hinzufügen Verfahren nach Extraktion: Verdünnen IC von 100 mal mit DNA Verdünnungsmittel Und hinzufügen 1 μl hinein jede qPCR Mischen
System.
**Das Bausatz tut nicht enthalten ROX Referenz Farbstoff. Wenn ROX Referenz Farbstoff Ist nötig für Die Real Zeit PCR Verstärker Das Du Sind momentan verwenden, 50×ROX Referenz Farbstoff (Cat#10200ES) ist empfohlen für verwenden. In Das Fall, die hinzugefügt Volumen Ist 0,8 μl, als gezeigt In Tisch 1. Wenn mit andere
Marken von ROX Produkte, bitte verweisen Zu ihre Anweisungen für ROX zusätzlich. Wenn NEIN ROX Referenz Farbstoff Ist erforderlich, die hinzugefügt Volumen Ist 0 μL.
3）Vorlagen hinzufügen
- Mischen Sie den qPCR-Mix unter ausreichendem Schütteln, zentrifugieren Sie bei niedriger Geschwindigkeit und sammeln Sie die Restflüssigkeit aus der Kappe
auf den Grund von die Röhre.
- Addiere 20 μL qPCR Mix in jedes Reaktionsgefäß/jede Vertiefung. Bitte beachten Sie, dass die Zugabe des entsprechenden qPCR Mix in jedes
Probenröhrchen und vermeiden Sie Additionsfehler.
- Fügen Sie Vorlagen zu den Röhrchen/Vertiefungen hinzu, die den qPCR-Mix enthielten. Informationen zum Hinzufügen von Vorlagen finden Sie in Tabelle 4.
| Testproben | In jedem Rohr bzw. Also … |
| TS | 20 μL qPCR-Mischung +20 μL Proben nach der Extraktion |
| NTC | 20 μL qPCR-Mischung +20 μL DNA Verdünnung Puffer |
| NCS* | 20 μL qPCR-Mischung +20 μL Negative Probe nach Extraktion* |
| PCS | 20 μL qPCR-Mischung +20 μL Positiv Kontrolle |
Tisch 4 Vorlagen Hinzufügen
*Wir empfehlen, DNA-Verdünnungspuffer (40619-E) als NCS-Vorlage für die DNA-Extraktion zu verwenden.
**Der gesamt Reaktion Volumen In jede Rohr/Brunnen Ist 40 μL.
***Abdeckung Die Rohr Deckel oder Die Platte Film. Zu vermeiden beeinflussend Die Fluoreszenz Signal Lesen, bitte nehmen Pflege nicht Zu markieren Die Rohr Deckel oder Film
oder sogar reiben Die Film wiederholt mit A Schaber.
****Zentrifuge Die Reaktion Rohr oder Platte knapp bei niedrig Geschwindigkeit nach Vorlagen Hinzufügen. Nach ausreichend Zittern Und mischen, wiederholen Zentrifuge
bei niedrig Geschwindigkeit Zu sammeln Die flüssig aus Die Deckel oder Wand Zu Die unten. Vermeiden Blasen Wann Betrieb. Die Basislinie Wille Sei betroffen Wenn Die mischen
Ist nicht gemischt also, also Das Schritt Ist sehr wichtig Zu A Gut Experiment Ergebnis.
4）qPCR-Programmeinstellung
- Programmdateieinstellungen
Beispiel (7500 Real-Time PCR System-Instrument und Real-Time PCR Software v2.4):
Instrumententyp: 7500 (96 Wells)
Versuchstyp: Quantifizierungs-Standardkurve;
Chemie: Taqman®-Reagenzien
Rampengeschwindigkeit: Standard (~2 Stunden, um einen Lauf abzuschließen)
- Zielkanaleinstellungen
In "Definieren Ziele Und Proben" von "Platte Aufstellen", erstellen A Ziel 1 Kanal (FAM), wählen FAM als Die Berichterstattung Fluoreszenzgruppe und MGB oder keiner als Abschreckung Fluoreszenz Gruppe. Erstellen A Ziel 2 Kanal (VIC), wählen Die Berichterstattung Fluoreszenz Gruppe als VIC Und Die Abschrecken Fluoreszenz Gruppe als keiner. In "Zuordnen Ziele Und Proben" von "Platte Aufstellen", Wenn NEIN zusätzlich ROX Farbstoff Ist hinzugefügt, wählen Sie "keiner"; Wenn ein zusätzlich ROX Ist hinzugefügt, wählen Sie
ROX.
- Standardeinstellungen des Verstärkungsprogramms
| Seriennummer | Reaktionsphase | Temperatur | Zeit | Zyklus(en) |
| 1 | Erste Denaturierung | 95℃ | 5 Min | 1 |
| 2 | Denaturierung | 95℃ | 15 Sek |
45 |
| 3 | Glühen/Verlängerung (Fluoreszenzsignalerfassung) |
62℃ |
30 Sek. |
Tabelle 5 Standard-Verstärkungsprogrammeinstellungen
- Grundlinien- und Schwellenwerteinstellung:
Prinzip von Basislinie Einstellung: verwenden Die automatisch Basislinie allgemein. Wenn brauchen Zu anpassen In Handbuch, wählen Die Zyklus vor dem exponentiellen Wachstum Zeitraum als Startzyklus und vermeiden Sie die Schwankungszone von anfänglich Fluoreszenz Sammlung. Wählen Sie den Zyklus, der 1-2 Zyklen vor dem Ct der frühesten exponentiellen Amplifikationsprobe liegt, als
Endpunkt.
Prinzip von Schwelle Anpassung: Verwenden Sie im Allgemeinen den automatischen Schwellenwert. Wenn Sie manuell anpassen müssen, sollen Sei Satz höher als Die Negativ Probe oder Die Basislinie Lärm, es ist allgemein Satz die Schwelle In Die spät
Stadium der Die exponentielle Verstärkung, relativer Unabhängigkeit und ein geeigneter Schwellenwert sind für jeden Tunnel erforderlich.
5) Ergebnis Analyse
- Ergebnisbeurteilung für PCS, NTC und NCS:
Wenn IC hinzugefügt wird: Die Spezifikation jeder Kontrollprobe sollte in Tabelle 6 erfüllt:
| Kontrollprobe | FAM Signal | VIC-Signal |
| PCS | Ct < 40 und hat eine deutliche Verstärkungskurve | Ct < 40 und hat eine deutliche Verstärkungskurve |
| NTC | Ct ≥ 40 oder keine offensichtliche Verstärkungskurve | Ct < 40 und hat eine deutliche Verstärkungskurve |
| NCS | Ct ≥ 40 oder keine offensichtliche Verstärkungskurve | Ct < 40 und hat eine deutliche Verstärkungskurve |
Tisch 6 Ergebnis Urteil von PCS, NTC Und NCS
Wenn IC nicht hinzugefügt wird: Jede Qualitätskontrollprobe muss die Spezifikation der Spalte FAM-Signal in Tabelle 6 erfüllen, und keine
müssen analysieren VIC-Kanal.
- Ergebnisbeurteilung für TS
Voraussetzung: Es Ist notwendig, um festzustellen, ob PCS, NTC und NCS die Spezifikation bestanden in Tabelle 6 vor TS Ergebnisanalyse. Wenn bestanden, dann kann weiter zum nächster Schritt. Wenn nicht bestanden, Die TS Ergebnisse Mai nicht Sei zuverlässig, Und
der Grund muss untersucht werden.
Wenn IC hinzugefügt wurde: Finden Sie die entsprechenden Ergebnisse Beurteilung nach den Ergebnisinformationen von FAM und VIC in Tabelle 7:
| FAM Signal | VIC-Signal | Ergebnis Urteil |
| Ct<40 und hat offensichtliche Verstärkungskurve | Ct<40 und hat eine deutliche Verstärkungskurve | Positiv |
| Ct≥40 oder keine offensichtliche Amplifikationskurve | Eine Hemmung besteht, die Experiment muss wiederholt werden | |
| Ct≥40 oder kein offensichtlicher Verstärkungskurve | Ct<40 und hat eine deutliche Verstärkungskurve | Negativ |
| Ct≥40 oder keine offensichtliche Amplifikationskurve | Eine Hemmung besteht, die Experiment muss wiederholt werden |
Tisch 7: Ergebnis Urteil von TS (IC hinzugefügt)
*Wenn Dort Ist Hemmung für VIC Signal, Behandlung Ist nötig Zu beseitigen Die Inhibitoren oder wiederholen Die prüfen.
Wenn IC nicht hinzugefügt wurde: Suchen Sie nach den entsprechenden Ergebnissen Urteil nach die Ergebnisinformationen von FAM in Tabelle 8 , und es ist nicht notwendig, die VIC-Signal.
| FAM-Signal | Ergebnis Urteil |
| Ct<40 und hat eine deutliche Verstärkungskurve | Positiv |
| Ct≥40 oder keine offensichtliche Amplifikationskurve | Negativ |
Tisch 8: Ergebnis Urteil von TS (IC nicht hinzugefügt)
Hinweise
- Bitte lesen Sie dieses Handbuch sorgfältig durch, bevor Sie dieses Kit verwenden. Das Experiment sollte auf standardisierte Weise durchgeführt werden, einschließlich Probenhandhabung, Vorbereitung des Reaktionssystems und Probenzugabe.
- Führen Sie die Probenzugabe und die Reagenzienvorbereitung möglichst auf Eis durch.
- Vor Gebrauch alle Reagenzien vortexen und gut mischen.
- Bitte bedienen Sie Laborkittel und Einweghandschuhe, für Ihre Sicherheit.
- Dieses Produkt ist nur für Forschungszwecke bestimmt.
[1] Zhao F, Wang X, Li Y, Chen X, Geng Z, Zhang C.Auswirkungen einer Nahrungsergänzung mit Epigallocatechin-Gallat auf die Fleischqualität und die antioxidative Muskelkapazität von Broilern, die akutem Hitzestress ausgesetzt sind. Animals (Basel). 2021;11(11):3296. Veröffentlicht am 18. November 2021. doi:10.3390/ani11113296(IF:2.752)
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