Polybrene (Hexadimethrinbromid), auch bekannt als Polybrene, ist ein kationisches Polymer, das häufig in DNA-Transfektionsexperimenten mit Säugetierzellen verwendet wird, um die Transfektionseffizienz von Liposomen zu verbessern. Es wird häufig bei der durch Retroviren und Lentiviren vermittelten Gentransfektion eingesetzt. Der Wirkungsmechanismus könnte die Neutralisierung der Sialinsäure auf der Zelloberfläche beinhalten, wodurch die Adsorption durch Überwindung der elektrostatischen Abstoßung mit Viruspartikeln erleichtert wird. Polybrene ist auch als Antikoagulans (Heparinantagonist) bekannt und wird häufig bei der Herstellung nicht spezifisch aggregierter roter Blutkörperchen verwendet. Darüber hinaus hat sich bei der Proteinsequenzierung gezeigt, dass niedrige Dosen von Polybrene den Abbau von Peptiden in automatisierten Sequenzierungsanalysen deutlich verbessern. Die Zugabe von Polybrene zu PVDF-Membranen kann auch die Membranaffinität erhöhen.

Spezifikation

Das Produkt wird in Form einer Lösung bereitgestellt. Das Pulver wird in 0,9 % NaCl zu einer 10 mg/ml-Lösung verdünnt, die dann mit einem 0,22-μm-Filter sterilisiert wird. Es wird für den Gebrauch normalerweise im Verhältnis 1:1000-1:2000 verdünnt, wobei die spezifischen Verdünnungsverhältnisse vom Zelltyp abhängen, wie in der entsprechenden Literatur beschrieben.

Versand und Lagerung

Transport und Lagerung werden bei -20 ºC empfohlen, die Haltbarkeit beträgt 2 Jahre. Es wird empfohlen, die Proben in Aliquots aufzuteilen und zu lagern, um wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen zu vermeiden.

Vorsichtsmaßnahmen:

1. Tragen Sie aus Sicherheits- und Gesundheitsgründen Laborkleidung und Einweghandschuhe.

2. Dieses Produkt dient nur Forschungszwecken.

Betriebsschritte

(als Referenz; spezifische Konzentrationen können variieren, siehe entsprechende Literatur):

Hinweis: Polybrene kann für bestimmte Zellen (wie terminal differenzierte Neuronen, DC-Zellen) eine erhebliche Toxizität aufweisen. Vor der ersten Verwendung wird daher ein Toxizitätstest empfohlen.

Experiment 1: Retrovirale Infektion

1. Vorbereitung des Stammes rekombinanter Retroviren: Kultivieren Sie Zellen, die eine Monoschicht transfektionierter Retrovirus-Verpackungszellen enthalten, in einer 100-mm-Schale mit 5 ml Wachstumsmedium (5 % Serum). Entfernen Sie nach 24 Stunden das Kulturmedium und filtern Sie es durch einen 0,45-μm-Filter.

2. Kultivierung von Zellen für die Infektion: In eine 100 mm Schale 10 mL komplettes Wachstumsmedium mit einer Zelldichte von 5×10⁵ pro Gericht.

3. Virusinfektion: Nach 24 Stunden Zellkultur das gesamte Kulturmedium entfernen. Zellen mit 2 ml Virusüberstand, der Polybrene enthält (Endkonzentration: 5-10 μg/ml), bei 37 °C für 3-6 Stunden infizieren.

4. Viruspartikel sammeln: 8 ml vollständiges Wachstumsmedium hinzufügen. Nach 2-3 Tagen Kultur das Kulturmedium sammeln, um Viruspartikel zu erhalten.

Experiment 2: Transfektion

1. Kultivieren Sie Zellen in vollständigem Wachstumsmedium mit einer Zelldichte von etwa 50 %.

2. Bereiten Sie nach 18-24 Stunden Zellkultur eine Mischung aus DNA-Wachstumsmedium und Polybren vor. Fügen Sie das vollständige Wachstumsmedium hinzu (2 ml für eine 60-mm-Schale, 3 ml für eine 100-mm-Schale) und heizen Sie es auf 37 °C vor. Mischen Sie vorsichtig 10 ng bis 10 µg Plasmid. Polybrene bis zu einer Endkonzentration von 5–10 μg/ml hinzufügen. Vorsichtig mischen. Die einzelnen Komponenten sollten in der angegebenen Reihenfolge hinzugefügt werden.

3. Entfernen Sie das Kulturmedium und geben Sie die DNA-Wachstumsmedium-Polybrene-Lösung bei 37 °C für 6–20 Stunden zu den Zellen. Mischen Sie die Lösung innerhalb der ersten 6 Stunden der Zellkultur alle 1,5 Stunden vorsichtig.

4. Entfernen Sie die DNA-Wachstumsmedium-Polybrene-Lösung. Bedecken Sie die Zellen mit DMSO-Schocklösung (15 % DMSO in 1 × HBSS).Um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten, schütteln Sie die Kulturschale bei jeder Zugabe der Lösung 10 Sekunden lang vorsichtig. Inkubieren Sie die Zellen 4 Minuten lang bei 37 °C.

5. Entfernen Sie sofort die DMSO-Schocklösung und waschen Sie die Zellen vorsichtig zweimal mit vollständigem Wachstumsmedium. Bei einer 60-mm-Schale waschen Sie sie jedes Mal mit 5 ml Kulturmedium und bei einer 100-mm-Schale waschen Sie sie jedes Mal mit 10 ml Kulturmedium.

6. Fügen Sie den Zellen komplettes Wachstumsmedium hinzu.

7. Proteinexpression: Sammeln Sie nach 24–72 Stunden Kultur bei Bedarf Zellen zur Proteinexpressionsanalyse.

Zellselektion: Nach 24–72 Stunden Kultur, je nach Zellstatus, auf frisches Selektionsmedium umstellen und mit der Zellselektion fortfahren.