Das linearisierte Polyethylenimin PEI 25000-Transfektionsreagenz ist ein hochgeladenes kationisches Polymer, das leicht negativ geladene Nukleinsäuremoleküle bindet, einen Komplex bildet und es dem Komplex ermöglicht, in die Zelle einzudringen. Das Transfektionsreagenz ist ein vorübergehendes Transfektionsreagenz mit geringer Zytotoxizität, hoher Transfektionseffizienz und hoher Genexpressioneffizienz in Zellen wie HEK293 und CHO. Es wurde nachgewiesen, dass das lineare PEI-Transfektionsreagenz für eine Vielzahl von Zelllinien, darunter HEK-293, HEK293T, CHO-K1, COS-1, COS-7, NIH/3T3, Sf9, HepG2 und Hela-Zellen usw., breit anwendbar ist. Das Reagenz ist mit serumhaltigen Medien kompatibel und kann Nukleinsäuren effizient in Zellen einführen.

Spezifikation

Versand und Lagerung

Das Produkt wird bei Raumtemperatur versandt und das Pulver kann zwei Jahre lang bei 2–8ºC gelagert werden. Die Stammlösung kann drei Monate lang bei 2–8ºC gelagert werden.

Vorsichtsmaßnahmen


1) Nachdem die vorbereitete PEI-Lösung aus -20 ºC entnommen und aufgetaut wurde, kann sie in einem 4 ºC-Kühlschrank gelagert werden und darf nicht erneut eingefroren werden.

2) Bei den meisten Zellen kann mit 3,0 μL PEI-Transfektionsreagenz pro 1 μg DNA eine hohe Transfektionseffizienz erreicht werden. Zur Optimierung können Sie auch versuchen, 1,5 bis 4 μL lineares PEI-Transfektionsreagenz pro 1 μg DNA zu verwenden.

3) Tragen Sie zu Ihrer Sicherheit und Gesundheit beim Betrieb bitte einen Laborkittel, Einweghandschuhe und eine Abzugshaube.

4) Dieses Produkt ist nur für wissenschaftliche Forschungszwecke und nicht für den menschlichen Gebrauch bestimmt.

Herstellung der Stammlösung (1 mg/ml)


1. Materialien

PEI 25000, Milli-Q®-Wasser/Wasser für Injektionszwecke (WFI) oder Wasser ähnlicher biologischer Qualität, 12 mol/l Salzsäure (HCl), 10 mol/l Natriumhydroxid (NaOH), Einweg-Vakuum-Sterilfilter 0,1–0,2 μm PES, sterile Aufbewahrungsflasche aus HDPE oder Polypropylen.

2. Stammlösung herstellen (1 mg/mL)

1) Geben Sie in ein 1-l-Becherglas 1 g PEI 25000-Pulver in 900 ml Milli-Q®-Reinstwasser oder ein anderes gleichwertiges biologisches Wasser und rühren Sie auf einem Magnetrührer gleichmäßig um, um einen kleinen Wirbel zu erzeugen.

2) Unter Rühren tropfenweise Salzsäure (12 mol/l) hinzufügen, um den pH-Wert anzupassen, bis pH < 2,0.

3) Bedecken Sie den Becher mit Deckel und rühren Sie 3 Stunden lang, bis sich alles vollständig aufgelöst hat. Halten Sie den pH-Wert während des gesamten Vorgangs unter 2,0.

【Hinweis】: Möglicherweise sind einige kleine Faserpartikel vorhanden, die sich nicht auflösen. Dies ist ein normales Phänomen.

4) Geben Sie unter Rühren tropfenweise NaOH (10 mol/l) hinzu, um den pH-Wert auf 6,9 – 7,1 einzustellen.

5) Übertragen Sie die Lösung in einen Messzylinder und fügen Sie Wasser hinzu, um auf 1 Liter aufzufüllen.

6) Filtern und mit einem Einweg-PES-Vakuumfilter (0,1–0,2 µm) sterilisieren, um eine Stammlösung (1 mg/ml) zu erhalten.

7) Nach Bedarf aliquotieren und bei -20 °C lagern, 1 Jahr haltbar.

【Hinweis】: Nach dem Wiederauftauen kann die Aufbewahrungslösung bei 4 °C gelagert werden und ist 2 Wochen haltbar, darf jedoch nicht wieder eingefroren werden

Transfektionsvorgang (am Beispiel einer 6-Well-Platte)


1. Zellimpfung: Um die Transfektionseffizienz zu verbessern, wird empfohlen, die Zellen einen Tag vor der Transfektion zu impfen. Die Zelldichte zum Zeitpunkt der Transfektion beträgt vorzugsweise 70–80 %.

2. Herstellung des DNA-PEI-Komplexes: Herstellung des DNA-PEI-Nukleinsäure-Transfektionsreagenz-Komplexes nach folgendem System:

1) Verdünnen Sie für jede Zellvertiefung 2 μg Ziel-DNA mit 100 μL serumfreiem Medium und mischen Sie dies gründlich, um eine DNA-Verdünnung zu erhalten.

[Hinweis]: Opti-MEM oder ddH2O wird als serumfreies Verdünnungsmittel empfohlen

2) Geben Sie sofort 5 μl PEI 25000-Transfektionsreagenz zu 100 μl DNA-Verdünnungsmittel hinzu, vortexen Sie 10 Sekunden lang und mischen Sie gut.

3) 10–25 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um einen DNA-PEI-Komplex aus kationischem Nukleinsäure-Transfektionsreagenz zu bilden.

3. Transfizierte Zellen:

1) Entfernen Sie während der Komplexbildung das Zellwachstumsmedium und geben Sie 2 ml frisches, vorgewärmtes Komplettmedium in jede Vertiefung.

2) Geben Sie 100 μL DNA-PEI-Nukleinsäure-PEI-Komplex direkt zu den Zellen, schütteln Sie die Kulturplatte und mischen Sie vorsichtig.

3) Kultivieren Sie es in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2. Die Expression des Transgens kann bereits 7 Stunden nach der Transfektion nachgewiesen werden. Bitte bestimmen Sie den geeigneten Testzeitpunkt selbst.

4. Dauerrotationssiebung (optional)

24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen in frisches Wachstumsmedium subkultiviert (die Zellen mehr als 10-fach verdünnen) und über Nacht bei 37 °C in einem 5 % CO2-Inkubator inkubiert. Am nächsten Tag wurde ein Screening-Medikament hinzugefügt, das zum Transfektionsresistenzgen passt. Arzneimittelresistente Klone können in etwa 1 bis 2 Wochen gescreent werden. Während dieser Zeit muss das Wachstumsmedium, das die Screening-Medikamente enthält, häufig ausgetauscht werden.

Transfektionsdosis für verschiedene Zellkulturgefäße (nur als Referenz):