Vero Das Host Cell DNA Residue Detection Kit wird zur quantitativen Analyse von Vero-Wirtszell-DNA-Rückständen in Zwischenproben, Halbfertig- und Fertigprodukten verschiedener biologischer Produkte verwendet.

Dieses Kit verwendet eine Taqman-Fluoreszenzsonde und die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die eine Mindestnachweisgrenze auf fg-Niveau aufweist und die restliche Vero-Zell-DNA spezifisch und schnell nachweisen kann. Das Kit muss zusammen mit dem Kit zur Probenvorbereitung für Rest-DNA (Kat.-Nr. 18461ES) verwendet werden.

Produkt Komponenten

^*IC: Interne Kontrolle

Versand und Lagerung

1. Versand auf Trockeneis und bei -20°C gelagert für 2 Jahr

2. Nach Erhalt der Ware prüfen und lagern Sie diese bitte umgehend bei der entsprechenden Lagertemperatur.

Vorsichtsmaßnahmen

1. Bitte lesen Sie dieses Handbuch sorgfältig durch, bevor Sie dieses Reagenz verwenden. Das Experiment sollte standardisiert werden, einschließlich Probenhandhabung, Vorbereitung des Reaktionssystems und Probenzugabe.

2. Das Hinzufügen von Proben und Vorbereiten von Lösungen erfolgt am besten auf Eis.

3. Stellen Sie sicher, dass jede Komponente vor der Verwendung vollständig verwirbelt und bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert wurde.

4. Bitte tragen Sie zu Ihrer Sicherheit und Gesundheit bei Operationen Laborkittel und Einweghandschuhe.

5. Dieses Produkt ist NUR für Forschungszwecke bestimmt!

Anwendbare Instrumentenmodelle

Einschließlich (jedoch nicht beschränkt auf):

Bio-Rad: Optisches Modul CFX96.

Thermo Scientific: ABI 7500; ABI Quant Studio 5; ABI-Schritt OnePlus.

Gebrauchsanweisung

1. Vero DNA-Standardverdünnung und Standardkurvenvorbereitung

Der Vero Die DNA-Kontrolle wurde mit dem im Kit enthaltenen DNA-Verdünnungspuffer gradientverdünnt. und die Verdünnungskonzentration beträgt 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL, 30 fg/μL, 3 fg/µL.

Detaillierte Anweisungen finden Sie weiter unten:

1.1 Auftauen Vero DNA-Kontrolle und DNA-Verdünnungspuffer auf Eis. Nach dem vollständigen Auftauen vorsichtig vortexen, um zu mischen, und 10 Sekunden bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugieren.

1.2 Sechs herausnehmen saubere 1,5-ml-Röhrchen, markiert mit 3 ng/μL, ①, ②, ③, ④, ⑤, ⑥.

1.3 Zugabe von 90 μL DNA-Verdünnungspuffer und 10 μL Vero DNA-Kontrolle zur 1.5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit der Aufschrift 3 ng/μL und verdünnen auf 3 ng/μL. Mischen und dann 10 Sekunden zentrifugieren. Den verdünnten DNA-Standard in Unterverpackungen verpacken und kurzfristig (nicht länger als 3 Monate) bei -80 °C lagern. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden.

1.4 90 μL DNA-Verdünnungspuffer in andere Röhrchen, und befolgen Sie dann das unten stehende Verfahren für die seriellen Verdünnungen.

[Anmerkungen]:

1. Für jede Konzentration sind drei Replikationsbohrungen erforderlich. Der Nachweisbereich beträgt 3 fg/µl – 300 pg/µl Und Dieser Bereich kann bei Bedarf erweitert werden.

2. Um die Anzahl der wiederholten Einfrier- und Auftauvorgänge zu reduzieren und eine Kontamination zu vermeiden, wird empfohlen, die DNA-Kontrollproben in Aliquots bei -80°C.

3. Nach dem Auftauen kann der DNA-Verdünnungspuffer bei 2-8°C lagern 7 Tage, bei längerer Nichtbenutzung bitte bei -20°C lagern.

4. Stellen Sie sicher, dass die Vorlage vollständig gemischt ist, schütteln Sie die Mischung vorsichtig 15 Sekunden bis 1 Minute lang für jede Gradientenverdünnung.

2. Vorbereitung der Extraktionswiederherstellungskontrolle (ERC)

Stellen Sie die Konzentration ein von Vero DNA im ERC nach Bedarf (die ERC-Probe wurde exemplarisch mit 3 pg/µL DNA hergestellt) wie folgt:

2.1 100 μL Probe in ein sauberes 1,5 mL Röhrchen geben, dann 10 μL 3pg/μL Vero hinzufügen DNA-Standard (③) und gut mischen, als ERC gekennzeichnet.

2.2 Durchführung der DNA-Extraktion der ERC-Probe zusammen mit den Testproben zur Herstellung des gereinigten ERC Probe.

3. Vorbereitung der positiven Kontrollprobe (PCS) (optional)

Stellen Sie die Konzentration ein von Vero DNA in PCS nach Bedarf (die PCS wurde exemplarisch mit 3 pg/µL DNA hergestellt) wie folgt:

3.1 Zugabe von 100 μL 3 pg/μL Vero DNA-Standard (③) in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen geben und dann als PCS kennzeichnen.

3.2 Durchführung der DNA-Extraktion von PCS zusammen mit den Testproben, um das gereinigte PCS herzustellen.

4. Negativ Vorbereitung der Kontrolllösung (NCS)

Stellen Sie die Negativkontrolle im Experiment ein. Die spezifischen Arbeitsschritte sind wie folgt:

4.1 100 μL hinzufügen Probenmatrix (oder DNA-Verdünnungspuffer) in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen geben und dann als NCS markieren.

4.2 Führen Sie die DNA-Extraktion der NCS-Probe zusammen mit den Testproben durch, um die gereinigte NCS-Probe vorzubereiten.

5. No Template Control (NTC)-Vorbereitung

Legen Sie die Nein-Vorlage fest Kontrolle im Experiment, die spezifischen Betriebsschritte sind wie folgt:

5.1 NTC erfordert keine Probenvorbehandlung und kann im Stadium der qPCR-Erkennung des Rest-DNA-Gehalts konfiguriert werden.

5.2 Die NTC-Probe in jedem Röhrchen oder jeder Vertiefung beträgt 20 μL Mischen (also 16 μL Vero qPCR-Mischung + 4 μL Vero Primer&Sondenmischung) + 20 μL DNA-Verdünnungspuffer. Es wird empfohlen, drei Replikationsvertiefungen zu konfigurieren.

6. PCR-Reaktionssystem

[Anmerkungen]:

1. Berechnen Sie das gesamte PCR-Reaktionsvolumen anhand der Anzahl der Reaktionen: qPCR-Mix = (Anzahl der Reaktionen + 2) × (16 + 4) μL (einschließlich der Verluste von zwei Reaktionskammern). Im Experiment werden mehr als drei Replikate für jede Probe empfohlen.

2. Nachdem Sie das Röhrchen verschlossen oder die Platte versiegelt haben, zentrifugieren Sie das Reaktionsröhrchen oder die Platte 10 Sekunden lang bei niedriger Geschwindigkeit. Nach ausreichendem Schütteln und Mischen für 5 Sekunden wiederholen Sie die Zentrifugation, um die Flüssigkeit vom Deckel oder der Wand auf den Boden zu sammeln. Vermeiden Sie Blasen während des Betriebs.

Die empfohlene Plattenkonfiguration finden Sie in der Tabelle unten:

Das Plattenlayout umfasst: 1 NTC (kein Vorlage Kontrolle), 1 NCS (Negativkontrolle Lösung), 6 STD (die Standardkurve von 6 Standardkonzentrationen), 3 TS (Testproben), 3 ERC (Extraktionsrückgewinnungskontrolle), 1 PCS (positive Kontrollprobe).Drei Replikationsvertiefungen für jede Probe.

7. Einrichtungsrichtlinien für ein PCR-Instrument (2-Stufen-Methode)

Die folgenden Anweisungen gelten nur für das Thermo ABI 7500 qPCR-Gerät (Softwareversion 2.0). Wenn Sie ein anderes Instrument verwenden, finden Sie die Einrichtungsrichtlinien im entsprechenden Instrumentenhandbuch.

7.1 Erstellen Sie ein neues Experiment und wählen Sie die Vorlage für die absolute Quantifizierung oder benutzerdefiniert.

7.2 Fügen Sie in der Schnittstelle „Definieren“ und im Bereich „Ziele“ ein Ziel mit dem Namen FAM hinzu, wählen Sie als Reporter „FAM“ und als Quencher „keine“.

7.3 Fügen Sie im Bereich „Proben“ nacheinander alle Probeninformationen hinzu. Wählen Sie dann die Vertiefungen aus, wählen Sie das Ziel und die Proben entsprechend aus. Stellen Sie die Aufgabe von Vero ein DNA-Standard als Standard und weisen Sie die Werte 300000, 30000, 3000, 300, 30, 3 zu (die Einheit der DNA-Konzentration in jeder Vertiefung ist fg/μL) in der Spalte „Quantität“ und benennen Sie die Vertiefungen mit STD 1, STD 2, STD 3, STD 4, STD 5, STD 6, entsprechend. Stellen Sie die Aufgabe von NTC als NTC ein. Stellen Sie NCS, TS, ERC ein und PCS als Unbekannt und benennen Sie sie entsprechend dem obigen Plattenlayout. Klicken Sie dann auf Weiter.

7.4 Stellen Sie das Amplifikationsprogramm ein: Stellen Sie das Reaktionsvolumen auf 40 μl ein.

8. Analyse der qPCR-Ergebnisse

8.1 Das System gibt den Schwellenwert im Amplifikationsdiagramm-Panel der Analyse automatisch an. Der vom System angegebene Schwellenwert liegt manchmal zu nahe an der Basislinie, was zu einem großen Unterschied im Ct zwischen den Replikationsvertiefungen führt. Sie können den Schwellenwert manuell auf eine geeignete Position einstellen und auf „Analysieren“ klicken. Anschließend können Sie zunächst im Mehrkomponentendiagramm überprüfen, ob die Amplifikationskurve normal ist.

8.2 Überprüfen Sie auf der Registerkarte „Ergebnisanalyse“ das Standardkurvendiagramm. Überprüfen Sie die Werte für Steigung, Y-Achsenabschnitt, R2 und Effizienz. Für eine normale Standardkurve gilt R²>0,99; 90 %≤Eff%≤110 %.

8.3 Im 'Wellentabelle anzeigen' Im Bereich „Analyse“ werden die Konzentrationen der einzelnen Proben in „Menge“ angezeigt. Die Einheit ist fg/μL. Die Einheiten können in pg/μL umgerechnet werden. oder pg/ml im Analysebericht.

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