Das Replikationskompetente Lentivirus (RCL) Detection Kit wird verwendet zur quantitativen Erkennung replizierender Lentiviren, die kann auftreten in einem Vielzahl von Zellprodukten im Zusammenhang mit lentiviralen Überträger potenzieller Risiken.

Dieses Kit entwickelt spezielle Primer für die VSV-G-Gensequenz lentiviraler Hüllproteine. Und es übernimmt Taqman  Fluoreszenzsonde und die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die eine Nachweisgrenze von 1 Kopien/μL hat und kann gezielt und schnell erkennen das replikationskompetente Lentivirusrisiko. Das Kit benötigt zu verwenden zusammen mit das Residual-DNA-Probenvorbereitungskit (Kat.-Nr. 18461ES).

Komponenten

* IC: Intern Kontrolle.

Lagerung

Dieses Produkt sollte bei -25~-15℃ gelagert werden. für 2 Jahre.

Sowohl 41311-A als auch 41311-B sollten lichtgeschützt gelagert werden.

Anwendbar Instrument Modelle

Einschließlich (jedoch nicht beschränkt auf): Bio-Rad: CFX96-Optikmodul; Thermo Scientific: ABI 7500; ABI Quant Studio 5; ABI-Schritt OnePlus.

Anweisungen

1. RCL-DNA Standard Verdünnung Und Standard Kurve Vorbereitung

Die RCL-DNA-Kontrolle wurde mit dem im Kit enthaltenen DNA-Verdünnungspuffer gradientverdünnt* und die Verdünnung Konzentration ist 5×10E7 Kopien/µL, 5×10E6 Kopien/µL, 5×10E5 Kopien/µL, 5×10E4 Kopien/µL, 5×10E3 Kopien/µL, 5×10E2 Kopien/µL, 5×10E1 Kopien/µL.

Detaillierte Anweisungen finden Sie weiter unten:

1) Tauen Sie die RCL-DNA-Kontrolle und den DNA-Verdünnungspuffer auf Eis auf. Nach dem vollständigen Auftauen Vorsichtig verwirbeln, um mischen und 10 Sekunden bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugieren.

2) Nehmen Sie sieben saubere 1,5-ml-Röhrchen heraus, die mit Std0, Std1, Std2, Std3, Std4, Std5, Std6 gekennzeichnet sind.

3) Addiere 90 μL DNA-Verdünnungspuffer und 10 μL RCL-DNA-Kontrolle in das 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit der Aufschrift „Std0“, nämlich   verdünnen auf 5×10E7 Kopien/μL. Mischen und dann 10 Sekunden zentrifugieren. Den verdünnten DNA-Standard unterverpacken und er kann kurzfristig gelagert (nicht länger als 3 Monate) bei -25~-15℃** .Bitte vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen.

4) Addiere 90 μL DNA-Verdünnungspuffer in andere Röhrchen*** , dann folgen Sie dem untenstehenden Verfahren für die Verdünnungsreihen**** .

Tabelle 1 Standardgradientenverdünnung

*Drei replizieren Brunnen Sind erforderlich für jede Konzentration.Die Erkennung Reichweite Ist 5×10E1 Kopien/µL~5×10E6 Kopien/µL Und Das Reichweite dürfen Sei bei Bedarf erweitert.

** Zu reduzieren Die Nummer von wiederholen Frost-Tau Und vermeiden Kontamination, es Ist empfohlen Zu speichern Die DNA Kontrolle In Aliquots bei -25 bis -15 °C für Die Erste Zeit.

*** Einmal aufgetaut, DNA Verdünnung Puffer könnte Sei gelagert bei 2-8°C für 7 Tage, wenn nicht gebraucht für A lang Zeit, bitte speichern bei -25 bis -15 °C .

**** Machen Sicher Die Vorlage Ist vollständig gemischt, sanft Shake Die Mischung für 15 Sekunden Zu 1 Minute für jede Gradient Verdünnung.

2. Extraktionswiederherstellung Kontrolle (ERC) Vorbereitung

Stellen Sie die Konzentration der RCL-DNA in ERC nach Bedarf ein (die ERC-Probe wurde mit 5×10E4 kopiert RCL DNA als ein Beispiel) wie folgt:

1) Addiere 100 μL Testprobe in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen geben und dann 10 μL 5×10E3 Kopien/μL RCL DNA Standard (Std4) und gut mischen, als ERC gekennzeichnet.

2) Führen Sie die DNA-Extraktion der ERC-Probe zusammen mit den Testproben durch, um die gereinigte ERC-Probe vorzubereiten.

3. Negative Kontrolle Lösung (NCS) Vorbereitung

Stellen Sie die Negativkontrolle im Experiment ein. Die spezifischen Arbeitsschritte sind wie folgt:

1) Addiere 100 μL Probenmatrix (oder DNA-Verdünnungspuffer) in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen geben und dann als NCS.

2) Führen Sie die DNA-Extraktion von NCS durch Probe zusammen mit den Testproben zur Herstellung des gereinigten NCS Probe.

4. Keine Vorlage Kontrolle (NTC) Vorbereitung

Stellen Sie im Experiment die Steuerung ohne Vorlage ein. Die spezifischen Betriebsschritte sind wie folgt:

1) NTC erfordert keine Probenvorbehandlung und kann im Stadium der qPCR-Erkennung von Rest-DNA konfiguriert werden Inhalt.

2) Die NTC-Probe in jedem Röhrchen oder jeder Vertiefung beträgt 20 μL Mischung (also 15 μL RCL qPCR-Mischung + 4 μL RCL Primer & Sonde Mischen + 1 μL IC) + 10 μL DNA-Verdünnungspuffer. Es wird empfohlen, drei Replikationsvertiefungen zu konfigurieren.

5. PCR Reaktion System

Tabelle 2 Reaktionssystem

* Berechnen Die gesamt PCR Reaktion Volumen von Die Nummer von Reaktionen: qPCR Mischen =(der Nummer von Reaktionen+2) × (15+4+1) μL (einschließlich Die Verluste von zwei Reaktionskammern). Im Experiment werden mehr als drei Replikate für jede Probe empfohlen.

** Nach Verdeckelung Die Rohr oder Abdichtung Die Platte, Zentrifuge Die Reaktion Rohr oder Platte bei niedrig Geschwindigkeit für 10 Sek. Nach ausreichend Zittern Und Mischen für 5 Sek., wiederholen Zentrifuge Zu sammeln Die flüssig aus Die Deckel oder Wand Zu Die unten. Vermeiden Blasen während Betrieb.

Die empfohlene Plattenkonfiguration finden Sie in der Tabelle unten:

Tabelle 3 Computer eingeschaltet Referenz Planke

Das Plattenlayout umfasst: 6 Std (die Standardkurve von 6 Standardkonzentrationen), 1 NTC (keine Vorlagenkontrolle), 1 NCS (negative Kontrolllösung), 3 TS (Testproben), 3 ERC (Extraktionsrückgewinnungskontrolle).Drei Replikationsbohrungen für jede Probe.

6. Einrichtungsrichtlinien für A PCR Instrument

Die folgenden Anweisungen gelten nur für Thermo ABI 7500 qPCR-Instrument (Software Version 2.0). Wenn Sie verwenden eine anderes Instrument, Richtlinien zur Einrichtung finden Sie im entsprechenden Instrumentenhandbuch.

1) Erzeugen Sie ein neues Experiment, wählen Sie die Vorlage der absoluten Quantifizierung oder benutzerdefiniert.

2) Erstellen Sie 1 Detektionssonde mit dem Namen „RCL-DNA“, wählen Sie als Reporter-Fluorophor „FAM“ und als Quench-Fluorophor "keine"; erstellen Sie 1 weitere Detektionssonde, nennen Sie sie "IC" und wählen Sie den Reporter-Fluorophor als "CY5" und Quenching Fluorophor als „keine“. Die Referenzfluoreszenz ist ROX" (die Referenzfluoreszenz kann auf der Grundlage der Instrumentenmodell usw., wählen Sie ob Sie müssen es hinzufügen).

3) Im Im Bereich „Proben“ fügen Sie nacheinander alle Probeninformationen hinzu. Wählen Sie dann die Vertiefungen aus, wählen Sie das Ziel und die Proben entsprechend. die Aufgabe des RCL DNA-Standards als Standard, und ordnen Sie die Werte 5000000, 500000, 50000, 5000, 500, 50 (die Einheit der DNA-Konzentration in jedem Well ist Kopien/μL) in der Spalte Menge und benennen Sie die  Brunnen Std 1, Std 2, Std 3, Std 4, Std 5, Std 6, entsprechend. Stellen Sie die Aufgabe von NTC als NTC. Stellen Sie NCS, TS und ERC als Unbekannt und entsprechend der obigen Plattenanordnung benannt. Klicken Sie dann auf „Weiter“.

4) Stellen Sie das Amplifikationsprogramm ein: Stellen Sie das Reaktionsvolumen auf 30 μl ein.

Tabelle 4 Amplifikationsverfahren

7. Analyse von qPCR Ergebnisse

1) Das System gibt automatisch den Schwellenwert an. Verstärkung Plot-Panel von Analyse. Der gegebene Schwellenwert vom System ist manchmal zu nahe an der Basislinie, was zu einem großen Unterschied führt in Ct zwischen Replikationsvertiefungen. Sie können manuell anpassen den Threshold auf eine geeignete Position und klicken Sie Analysieren. Dann können Sie zunächst überprüfen ob die Amplifikationskurve im Mehrkomponentendiagramm normal ist.

2) Im Ergebnis Überprüfen Sie auf der Registerkarte „Analyse“ das Diagramm der Standardkurve. Überprüfen Sie die Werte für R2, Effizienz, Steigung und Y-Achsenabschnitt. Für eine normale Standardkurve gilt: R² > 0,99, 90 % ≤ Eff % ≤ 110 %, -3,6 ≤ Steigung ≤ -3,1.

3) Im 'Sicht gut Tabelle' Fenster in Analyse, die Konzentrationen der einzelnen Proben werden in Menge angezeigt, die Einheit beträgt Kopien/µL, die Einheiten können im Testbericht umgerechnet werden.

4) Die Parametereinstellungen von Die Ergebnisanalyse muss auf dem spezifischen Modell und der Software basieren Version verwendet und können im Allgemeinen vom Instrument automatisch interpretiert werden.

5) Berechnen Sie die Spike-Wiederherstellungsrate auf der Grundlage der Testergebnisse von das Beispiel TS zu messende Probe und der Probenspike Recovery ERC, die Rückgewinnungsrate von Spikes sind erforderlich zwischen 50 % und 150 % liegen.Formel für die erhöhte Rückgewinnungsrate:

Rückgewinnung (%) = {Sample spiked assay (eg.copies/μL) - Sample assay (eg.copies/μL)} x Elutionsvolumen (μL) / Theoretisch Wert der hinzugefügten DNA-Menge (z. B. Kopien) x 100 %.

6) Der CT Wert von die Negativkontrolle NCS sollte größer sein als der Mittelwert von die niedrigste Konzentration Ct von Die Standard.

7) Vorlagenfreie Steuerung NTC sollte unbestimmt oder Ct sein Wert ≥38.

Hinweise

1. Dieses Produkt ist nur für Forschungszwecke bestimmt.
2. Bitte tragen Sie zu Ihrer Sicherheit Laborkittel und Einweghandschuhe.

3.Bitte lesen Sie dieses Handbuch sorgfältig durch, bevor Sie es verwenden Dieses Reagenz und das Experiment sollten standardisiert werden, einschließlich Probenhandhabung, Vorbereitung des Reaktionssystems und Probenzugabe.

4. Stellen Sie sicher, dass jede Komponente vor der Verwendung vollständig verwirbelt und bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert wurde.

Handbuch