Das Testkit für reaktive Sauerstoffspezies verwendet das zelldurchlässige Reagenz 2',7'-Dichlorfluorescin-Diacetat (DCFDA), um reaktive Sauerstoffspezies in lebenden Zellproben quantitativ zu bestimmen. Das lipophile, nicht fluoreszierende DCFDA durchdringt die Zellmembran problemlos durch passive Diffusion, gefolgt von Deacetylierung. Das deacylierte Produkt ist ein oxidationsempfindliches 2',7'-Dichlorfluorescein (DCHF). DCHF wird später durch ROS zu DCF oxidiert. DCF ist stark fluoreszierend und wird durch Fluoreszenzspektroskopie oder Durchflusszytometrie mit Anregung/Emission bei 480 nm/525 nm nachgewiesen. Rosup, eine Verbindungsmischung, ist ein ROS-Induktor und kann als positive Kontrolle verwendet werden.

Produktkomponenten

Versand und Lagerung

Dieses Kit wird mit einem Eisbeutel geliefert. 1 Jahr lang bei -20 °C ohne Licht lagern. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden.

Anwendung

1. Reagenzvorbereitung
DCFH-DA-Lösung: Vor dem Öffnen kurz bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugieren. Bereiten Sie eine DCFH-DA-Arbeitslösung vor, indem Sie 10 mM DCFH-DA in serumfreiem Medium verdünnen, um eine Endkonzentration von 10 μM zu erhalten.
[Hinweis]: DCFH-DA kann auch in Medien ohne Phenolrot verdünnt werden. Verwenden Sie frisch zubereitete DCFH-DA-Lösung, eine langfristige Lagerung von verdünntem DCFH-DA wird nicht empfohlen. Die genaue erforderliche Konzentration von DCFH-DA hängt von der verwendeten Zelllinie ab, aber ein allgemeiner Ausgangsbereich wäre 10-50 μM. Bei bestimmten Zellen, wenn die Fluoreszenz der Negativkontrolle (ohne DCFH-DA-Sonde) sehr stark ist, verdünnen Sie DCFH-DA auf 2-5 μM und verkürzen Sie die Inkubationszeit angemessen.
Rosup-Lösung: Bereiten Sie eine 100 µM Rosup-Arbeitslösung vor, indem Sie 100 mM Rosup-Stammlösung in serumfreiem Medium verdünnen. Im Allgemeinen kann eine Inkubation mit Rosup bei 37 ℃ für 30 min-4 h im Dunkeln ROS deutlich erhöhen.
[Hinweis]: Die Inkubationszeit von Rosup hängt von der Empfindlichkeit der Zelllinie ab. Beispielsweise 30 Minuten für Hela und 1,5 Stunden für MRC5. Wenn innerhalb von 30 Minuten kein Anstieg von ROS beobachtet wird, kann die Induktionszeit oder die Konzentration entsprechend erhöht werden. Wenn ROS zu schnell ansteigt, kann die Induktionszeit oder die Konzentration entsprechend reduziert werden.
Arzneimittel: Bereiten Sie das betreffende Arzneimittel in einem Komplettmedium mit 10 % FBS oder einer anderen geeigneten Lösung bis zur gewünschten Konzentration vor.
2. Empfohlenes Protokoll für adhärente Zellen
a) Zellvorbereitung: Züchten Sie am Tag vor dem Experiment anhaftende Zellen in Standard-Zellkulturmedien, sodass die Zellkonfluenz zum Zeitpunkt des Experiments 70 % erreicht.
b) Arzneimittelinduktion: Entfernen Sie das Medium. Überschichten Sie jede Vertiefung mit zuvor hergestellten serumfreien verdünnten Arzneimitteln und inkubieren Sie sie für die gewünschte Zeit bei 37 °C im Dunkeln.
c) (Optional) Positive Kontrolle: Überschichten Sie die Vertiefung der positiven Kontrolle mit der zuvor zubereiteten Rosup-Lösung und inkubieren Sie sie für die gewünschte Zeit bei 37 °C im Dunkeln.
[Hinweis]: Bei Zellen mit kurzer Stimulationszeit (normalerweise innerhalb von 2 Stunden) kann die Sonde auch zuerst geladen und dann Rosup oder ein anderes Medikament von Interesse hinzugefügt werden.
d) Laden der ROS-Sonde: Entfernen Sie das gesamte Medium und waschen Sie die Zellen 1–2 Mal mit serumfreiem Medium. Überschichten Sie jede Vertiefung mit der zuvor hergestellten DCFH-DA-Lösung. Inkubieren Sie sie 30 Minuten lang im Dunkeln bei 37 °C.
e) Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen 1–2 Mal mit serumfreiem Medium, um freies DCFH-DA zu entfernen.
3. Empfohlenes Protokoll für Suspensionszellen
a) Zellvorbereitung: Züchten Sie Suspensionszellen am Tag des Experiments auf ungefähr 1,5 × 105 Zellen pro Vertiefung.
b) Arzneimittelinduktion: Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation in einem konischen Röhrchen, suspendieren Sie sie in einer geeigneten Menge zuvor hergestellter, serumfreier, verdünnter Arzneimittel und inkubieren Sie sie für die gewünschte Zeit bei 37 °C im Dunkeln.
c) (Optional) Positive Kontrolle: Die positiven Kontrollzellen mit zuvor hergestellter Rosup-Lösung resuspendieren und für die gewünschte Zeit bei 37 °C im Dunkeln inkubieren.
d) Laden der ROS-Sonde: In einem neuen Röhrchen sammeln und die Zellen durch zweimaliges Zentrifugieren in PBS waschen. Die Zellen mit zuvor hergestellter DCFH-DA-Lösung mit einer Zelldichte von 1×106-2×107/ml resuspendieren. Dann 30 Minuten lang im Dunkeln bei 37 °C inkubieren. Das Röhrchen alle 3–5 Minuten umdrehen, um vollständigen Kontakt zwischen der Sonde und den Zellen sicherzustellen.
[Hinweis]: Die Zelldichte sollte entsprechend der nachfolgenden Nachweismethode angepasst werden. Beispielsweise sollte bei der Durchflusszytometrie die Anzahl der Zellen in einem einzelnen Röhrchen nicht weniger als 104/ml und nicht mehr als 106/ml betragen.
e) Sammeln und waschen Sie die Zellen durch zweimaliges Zentrifugieren mit serumfreiem Medium, um freies DCFH-DA zu entfernen.
4. Fluoreszenzdetektion und Datenanalyse
Fluoreszenzmikroskopie-Messung: Führen Sie eine Lebendzellmikroskopie mit einem für Fluorescein (FITC) geeigneten Filtersatz unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops durch. Bewerten Sie die Helligkeit der Zellen visuell und vergleichen Sie sie zwischen Kontrolle und Proben oder verwenden Sie Bildanalysemethoden, um Signale zwischen digitalen Zellfotos zu vergleichen.
Durchflusszytometriemessung: Die anhaftenden Zellen sollten mit Trypsin gesammelt werden, um eine Einzelzellsuspension herzustellen. Bei Suspensionszellen werden die Zellen direkt gesammelt. Im Idealfall sollten 10.000 Zellen pro Versuchsbedingung analysiert werden. Die Zellen sollten während des Versuchs nicht zu dicht sein (<1 × 106 Zellen/ml). Trennen Sie Zelltrümmer und isolieren Sie die Zellpopulation von Interesse durch Gating. Bestimmen Sie mithilfe der mittleren Fluoreszenzintensität die Veränderung zwischen Kontroll- und behandelten Proben mit Ex/Em = 480/525 nm.
Fluoreszenz-Mikroplattenmessung: Messen Sie die Platte sofort auf einem Fluoreszenz-Plattenlesegerät bei Ex/Em = 480/525 nm im Endpunktmodus in Gegenwart von Medien. Subtrahieren Sie Leerwerte von allen Messungen und bestimmen Sie die Veränderungsrate gegenüber der Testkontrolle.

Vorsichtsmaßnahmen

1. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation mit DCFH-DA, um Hintergrundrauschen zu reduzieren.
2. Es wird empfohlen, die Fluoreszenz so bald wie möglich nach der Inkubation zu messen, um mögliche Fehler zu vermeiden.
3. Bitte tragen Sie zu Ihrer Sicherheit und Gesundheit während der Operation Laborkittel und Einweghandschuhe.
4. Nur für Forschungszwecke!