Puromycin ist ein Aminoglykosid-Antibiotikum, das durch Fermentation und Metabolisierung von Streptomyces alboniger entsteht und Gram-positive Bakterien sowie verschiedene Tier- und Insektenzellen durch Hemmung der Proteinsynthese abtötet. Puromycin ist in einigen Fällen gegen E. coli wirksam. Der Mechanismus besteht darin, dass : Puromycin ist ein Analogon des 3'-Terminus von Aminoyl-TrNA-Molekülen, das an die A-Stelle des Ribosoms binden und in die erweiterte Peptidkette eingebaut werden kann. Nachdem Puromycin an die A-Stelle gebunden hat, nimmt es an keinen nachfolgenden Reaktionen teil, was zu einem vorzeitigen Abbruch der Proteinsynthese und zur Freisetzung unreifer Polypeptide führt, die Puromycin am C-Terminus enthalten.

Das im Puromycin-produzierenden Stamm Streptomyces alboniger gefundene Pac-Gen kodiert eine Puromycin-N-Acetyltransferase (PAC), die Resistenz gegen Puromycin verleiht. Diese Eigenschaft wird heute allgemein genutzt, um stabil transfizierte Zelllinien von Säugetieren zu screenen, die Pac-Genplasmide tragen.

Die allgemeine Anwendung von Puromycin bei der Auswahl stabiler Zelltransfektionen hängt mit den Eigenschaften lentiviraler Vektoren zusammen. Die meisten kommerziellen lentiviralen Vektoren tragen heute das Pac-Gen. In einigen speziellen Fällen kann Puromycin auch zum Screening auf die Transformation von E. coli-Stämmen verwendet werden, die das Pac-Genplasmid tragen.

Dieses Produkt ist für die Zellkultur geeignet, die übliche Arbeitskonzentration beträgt 1–10 µg/ml.

Darüber hinaus bietet die Firma Yeasen auch Puromycin (Kat.-Nr. 60209ES) in Lösungsform an, das zwar einen anderen Zustand aufweist, aber die gleiche Funktion hat.

Merkmale

Reinheit≥98 %

Anwendungen

Geeignet für die Zellkultur

Sbildschirmspezifische, stabil transfizierte Säugetierzellstämme mit Plasmiden, die das Pac-Gen tragen

Bildschirm Die transformierte E. coli-Stämme mit dem pac-Genplasmid

Technische Daten

Komponenten

Versand und Lagerung

Der PUromycin DIhydrochlorid Produkte sollten bei -15℃ gelagert werden ~ -25℃ für 2 Jahre.

Anweisungen

1. Empfohlene Arbeitskonzentration

Säugetierzellen: 1-10 μg/ml, optimale Konzentration muss anhand der Abtötungskurve bestimmt werden.

Escherichia coli: LB-Agarmedium wurde verwendet, um Escherichia coli zu screenen, das stabil mit dem Pac-Gen in einer Konzentration von 125 transformiert war. μg/ml.

Notiz: Das Screening stabiler E. coli-Stämme mit Puromycin erfordert eine präzise pH-Einstellung.

Empfohlene Konzentrationen von : Puromycin Hydrochlorid

2. Auflösungsmethode

Puromycin in destilliertem Wasser auflösen, um eine Stammlösung von 50 mg/ml herzustellen. Nach Sterilisation durch Filtration durch eine 0,22 μm Filtermembran, aliquotieren und bei -25 bis -15 lagern℃Alternativ kann es in Methanol gelöst werden, um eine Aufbewahrungslösung von 10 mg/ml herzustellen.

3. Bestimmung von : Puromycin Abtötungskurve (am Beispiel der shRNA-Transfektion oder der Lentivirus-Transduktion)

Die effektive Abschirmkonzentration von : Puromycin hängt mit Zelltyp, Wachstumszustand, Zelldichte, Zellstoffwechsel und Zellzyklusposition zusammen. Um nach stabil exprimierenden shRNA-Zelllinien zu suchen, ist es wichtig, die Mindestkonzentration von Puromycin zu bestimmen, die nicht transfizierte/transduzierte Zellen abtötet. Kunden, die zum ersten Mal Experimente durchführen, wird empfohlen, eine Abtötungskurve zu erstellen, die für ihr eigenes Versuchssystem geeignet ist.

1) Tag 1: Die 24-Well-Platte wird mit einer Dichte von 5-8×104 Zellen/Well, und eine ausreichende Anzahl von Wells werden für nachfolgende Gradientenexperimente plattiert. Die Zellen wurden über Nacht bei 37℃.

2) Tag 2: A) Vorbereitung des Screeningmediums: frisches Medium mit verschiedenen Konzentrationen von Puromycin (z. B. 0-15 μg/mL, mindestens 5 Gradienten); B) Ersetzen Sie das frisch zubereitete Screeningmedium in den Zellen nach der Inkubation über Nacht. Anschließend werden die Zellen bei 37℃.

3) Tag 4: Durch frisches Selektionsmedium ersetzen und Zelllebensfähigkeit beobachten.

4) Je nach Wachstumszustand der Zellen alle 2-3 Tage auf frisches Selektionsmedium wechseln.

5) Die Zellen wurden täglich überwacht, um den Anteil lebender Zellen zu beobachten und die niedrigste Arzneimittelkonzentration zu bestimmen, mit der nicht-transfizierte oder alle nicht-transduzierten Zellen innerhalb von 4–6 Tagen nach Beginn des Antibiotika-Screenings abgetötet werden.

4. Screening stabil transfizierter Säugetierzelllinien

Nach der Transfektion des Plasmids, das das Pac-Gen enthält, wurden die Zellen in einem Puromycin-haltigen Medium vermehrt, um stabile Transfektanten auszuwählen.

1) 48 Stunden nach der Transfektion werden die Zellen (original oder verdünnt) in frischem Medium mit einer geeigneten Puromycin-Konzentration kultiviert.

Hinweis: Antibiotika sind am wirksamsten, wenn sich die Zellen aktiv teilen. Wenn die Zellen zu dicht sind, wird die Wirksamkeit der Antibiotika deutlich reduziert. Es ist am besten, die Zellen auf eine Dichte von nicht mehr als 25 % zu plattieren.

2) Entfernen und ersetzen Sie das Nährmedium mit : Puromycin alle 2-3 Tage.

3) Zellförmige Herde werden 7 Tage nach dem Screening beurteilt. Läsionen können je nach Wirtszelllinie und Effizienz des Transfektionsscreenings eine weitere Woche oder länger benötigen.

Hinweis: Beobachten Sie den Zellwachstumsstatus täglich. Das Screening von Puromycin erfordert mindestens 48 Stunden, und der Screeningzeitraum der wirksamen Konzentration von Puromycin beträgt im Allgemeinen 3-10 Tage.

4) Übertragen Sie 5-10 resistente Klone in eine 35 mm Petrischale und kultivieren Sie sie 7 Tage lang mit Selektionsmedium weiter. Diese Anreicherungskultur dient zur Vorbereitung auf zukünftige Zytotoxizitätsexperimente.

Unterlagen:

Sicherheitsdatenblatt

60210_MSDS_HB220421_DE.pdf

Benutzerhandbücher

60210_Handbuch_HB250114_DE.pdf

Zitate und Referenzen:

[1] Furge KA. et al., 2001. Unterdrückung der Ras-vermittelten Tumorigenität und Metastasierung durch Hemmung der Met-Rezeptor-Tyrosinkinase. PNAS 98:10722-7.

[2] Díaz J. et al., 2014.Rab5 wird in metastasierten Krebszellen für die Caveolin-1-verstärkte Rac1-Aktivierung, Migration und Invasion benötigt. J Cell Sci. 127:2401-6.

[3] Rössger K. et al., 2013. Belohnungsbasierte Hypertoniekontrolle durch eine synthetische Gehirn-Dopamin-Schnittstelle. PNAS, 110:18150-5.

[4] Kamer I. et al., 2005. Proapoptotisches BID ist ein ATM-Effektor in der DNA-Schadensreaktion Zelle. 122:593-603.

[5] Charnaux N. et al., 2005. RANTES (CCL5) induziert eine CCR5-abhängige beschleunigte Abspaltung von Syndecan-1 (CD138) und Syndecan-4 aus HeLa-Zellen und -Formen.

[6] Gao J, Zhao N, Knutson MD, et al. Das hereditäre Hämochromatoseprotein HFE hemmt die Eisenaufnahme durch Herunterregulierung von Zip14 in HepG2-Zellen[J]. Journal of Biological Chemistry, 2008, 283(31):21462-8.

[7] Huang J, Dibble CC, Matsuzaki M, et al. Der TSC1-TSC2-Komplex ist für die ordnungsgemäße Aktivierung von mTOR2 erforderlich[J]. Molecular and Cellular Biology, 2008, 28(12):4104-4115.

[8] Nasser MW, Datta J, Nuovo G, et al. Nasser MW, Datta J, Nuovo G, Kutay H, Motiwala T, Majumder S, Wang B, Suster S, Jacob ST, Ghoshal KDown-Regulation von Mikro-RNA-1 (miR-1) bei Lungenkrebs. Unterdrückung der tumorogenen Eigenschaft von Lungenkrebszellen und ihre Sensibilisierung für Doxorubicin-induzierte Apoptose durch miR-1. J Biol Chem 283: 33394-33405[J]. Journal of Biological Chemistry, 2008, 283(48):33394-33405.

[9] Paatero AO, Hilkka T, Happonen LJ, et al. Integration des Bakteriophagen Mu in Hefe- und Säugetiergenome[J]. Nucleic Acids Research, 2008, 36(22): e148-e148.

[10] Zhang D, et al. Ein nichtkanonischer cGAS-STING-PERK-Signalweg erleichtert das für Seneszenz und Organfibrose entscheidende Translationsprogramm. Nat Cell Biol. 2022 Mai;24(5):766-782. doi: 10.1038/s41556-022-00894-z. Epub 2022 Mai 2. PMID: 35501370.

[11] Lu T, et al. CD73 in kleinen extrazellulären Vesikeln aus HNSCC definiert eine tumorassoziierte Immunsuppression, die durch Makrophagen in der Mikroumgebung vermittelt wird. J Extracell Vesicles. 2022 Mai;11(5): e12218. doi: 10.1002/jev2.12218. PMID: 35524455; PMCID: PMC9077142.

[12] Chen S, et al.Identifizierung der Ubiquitin-spezifischen Protease 32 als Onkogen im Glioblastom und die zugrundeliegenden Mechanismen. Sci Rep. 2022 Apr 19;12(1):6445. doi: 10.1038/s41598-022-09497-y. PMID: 35440702; PMCID: PMC9018837.

[13] Han L, et al. Uterus globulin associated protein 1 (UGRP1) bindet Podoplanin (PDPN), um einen neuen Entzündungsweg während einer Infektion mit Streptococcus pneumoniae zu fördern. Clin Transl Med. 2022 Jun;12(6): e850. doi: 10.1002/ctm2.850. PMID: 35652821; PMCID: PMC9161880.

[14] Sun Q et al. MORTALIN-Ca2+-Achse fördert angeborene Rituximab-Resistenz bei diffusem großzelligem B-Zell-Lymphom. Cancer Lett. 2022 Jul 1; 537:215678. doi: 10.1016/j.canlet.2022.215678. Epub 2022 Apr 18. PMID: 35447282.