G418-Sulfat, auch bekannt als Geneticin-Sulfat, ist ein Aminoglykosid-Antibiotikum und strukturell ähnlich wie Gentamycin B1. Es stört die Proteinsynthese, indem es 80er-Ribosomen bindet und Verlängerungsschritte blockiert. G418-Sulfat ist sowohl für prokaryotische als auch eukaryotische Zellen toxisch, darunter Bakterien, Hefen, höhere Pflanzen- und Säugetierzellen sowie Protozoen und Würmer. Das Resistenzgen (hauptsächlich Neo), das sich im Transposon Tn601 (903) oder Tn5 befindet, stammt aus Bakterien, kann aber in eukaryotischen Zellen exprimiert werden. Das Resistenzgen kann durch Genrekombinationstechniken in Zellen eingeführt werden, um eine Resistenz gegen G418 zu erreichen, die zum Screening und zur Aufrechterhaltung der Kultur prokaryotischer oder eukaryotischer Zellen verwendet werden könnte, die das Resistenzgen tragen.

In Säugetierzellen kodiert neo die Expression von Aminoglykosid-3'-Phosphotransferase (APH (3') II) nach Integration in das eukaryotische Genom. Dieses Enzym inaktiviert das Antibiotikum, indem es die Amino- oder Hydroxylfunktion von G418 kovalent modifiziert und die Wechselwirkung zwischen Antibiotikum und Ribosom hemmt, wodurch die Zelle eine G418-Resistenz erhält. Bei Screening-Experimenten mit stabilen Zelllinien sollten die Abtötungskurven (Dosis-Wirkungs-Kurven) erstellt werden, um die minimale wirksame Konzentration zum Abtöten nichtresistenter Zellen zu bestimmen.

In Pflanzenzellen kann Resistenz durch Transfektion eines resistenten Plasmids mit dem nptII-Gen erreicht werden. Das nptII-Gen kodiert auch Aminoglycosidphosphotransferase, ein Enzym, das mehrere Antibiotika inaktiviert, darunter G418, Kanamycin und Palomycin.

Merkmale

Reinheit≥98 %

Standardisierte Produktion im Fabrik-Massenproduktionsmodus

Breites Anwendungsspektrum, das in den Bereichen Molekularbiologie und biochemische experimentelle Forschung an Gewebekulturen eingesetzt werden kann

Die Kooperationsplattform deckt den gesamten

Um die Stabilität der Produktqualität zu gewährleisten, wird der Unterschied zwischen den Chargen auf 1 % begrenzt.

Anwendungen

Screening stabil transfizierter Zelllinien

Technische Daten

Komponenten

Versand und Lagerung

Der G418 Sulfat (Geneticin) Produkte sollten bei -15℃ gelagert werden ~ -25℃ für 3 Jahre.

Anweisungen

1. Herstellung der G418-Aufbewahrungslösung (50 mg/ml, aktive Konzentration)

1) Umrechnung von Leistungseinheiten

Die Umrechnung erfolgte nach folgender Formel: (1000/A0) ×A1=A2

A0: Wirksamkeitswert von G418, der von Charge zu Charge variiert. Siehe Chargenqualitätsbericht oder Etikett auf der Flasche.

A1: Die von Ihnen gewünschte Konzentration an aktivem G418.

A2: Die tatsächliche Konzentration von G418.

Wenn beispielsweise der G418-Aktivitätswert der Charge 750 U/mg beträgt und die aktive Konzentration von G418 50 mg/ml beträgt, beträgt die tatsächlich herzustellende Pulverkonzentration 1000/750 × 50 mg/ml = 66,67 mg/ml. Wenn 10 ml G418-Aufbewahrungslösung (aktive Konzentration 50 mg/ml) hergestellt werden, müssen 666,7 mg Pulver abgewogen werden.

2) Sterilisation und Konservierung

Wiegen Sie das durch die obige Umrechnung erhaltene Pulver und geben Sie 10 ml steriles deionisiertes Wasser hinzu, um es vollständig aufzulösen.

Befeuchten Sie den 0,22-μm-Nadelfilter mit 5 ml sterilem deionisiertem Wasser vor und sterilisieren Sie die G418-Lösung anschließend durch Filtration.Teilen Sie die sterilisierte G418-Lösung in Aliquots auf und lagern Sie sie bei -20 °C.

Hinweis: ① Filtern Sie die trübe Lösung nicht, da sich die Lösung nicht vollständig aufgelöst hat. Der Filtrationsprozess führt zu einem Verlust des Wirkstoffs und verringert die Aktivität der endgültigen Lösung. ② Es wird nicht empfohlen, zur Herstellung der Aufbewahrungslösung Kulturmedien, Phosphatlösungen oder organische Lösungsmittel zu verwenden.

2. Häufig verwendete Screening-Konzentration

Im Allgemeinen ist zunächst eine hohe Konzentration von G418 erforderlich, um Transforter zu screenen, und eine niedrige Konzentration wird verwendet, um die Kultur aufrechtzuerhalten. Wachstumsbedingungen, Zelltypen und andere Umweltfaktoren können die wirksame Dosierung von G418 beeinflussen, daher wird empfohlen, die optimale Screening-Konzentration anhand der Abtötungskurve (Dosis-Wirkungs-Kurve) zu bestimmen.

Im Allgemeinen beträgt der Screeningbereich für Säugetierzellen 200–2000 μg/ml, für Pflanzenzellen: 10–100 μg/ml, für Hefezellen: 500–1000 μg/ml.

Experimentelle Daten zur Zelllinie

3. Festlegung der Abtötungskurve

Hinweis: Um nach Zelllinien mit stabiler Expression von Zielproteinen zu suchen, muss die Mindestkonzentration an Antibiotika bestimmt werden, die nicht transfizierte Wirtszellen abtöten kann. Dies kann durch die Erstellung einer Abtötungskurve (Dosis-Wirkungs-Kurve) erreicht werden. Es sollten mindestens sechs Konzentrationen ausgewählt werden. G418 ist bei der Behandlung mitotischer Zellen am aktivsten, daher müssen die Zellen vor der Zugabe von G418 eine Zeit lang kultiviert werden.

1) Tag 1: Untransformierte Zellen werden auf eine geeignete Kulturplatte mit einer Zelldichte von 20-25 % bei 37℃ gegeben und über Nacht in CO kultiviert.₂;

Hinweis: Bei Zellen, die zur Feststellung der Lebensfähigkeit eine höhere Dichte benötigen, kann die Inokulationsmenge erhöht werden.

2) Stellen Sie den G418-Konzentrationsgradienten je nach Zelltyp im entsprechenden Bereich ein. Säugetierzellen können auf 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/ml eingestellt werden.

3) Tag 2: Entfernen Sie das alte Medium und ersetzen Sie es durch ein frisch zubereitetes Medium mit der entsprechenden Arzneimittelkonzentration. Machen Sie für jede Konzentration drei parallele Ansätze.

4) Anschließend alle 3–4 Tage durch frisches Medium mit G418 ersetzen.

5) Lebendzellzählungen werden in einem festen Zyklus (z. B. alle 2 Tage) durchgeführt, um die geeignete Konzentration zu bestimmen. Wählen Sie die Mindestkonzentration, die die Mehrzahl der Zellen innerhalb einer idealen Anzahl von Tagen (normalerweise 7-10 Tage) abtötet, als Arbeitskonzentration für das Screening stabiler Transfektionszellen.

4. Screening stabiler transfizierter Zellen

1) 48 Stunden nach der Transfektion wurde G418-Kulturmedium mit geeigneter Konzentration zur Subkultur verwendet (direkte Subkultur oder verdünnte Subkultur).

Hinweis: Um gute Screening-Ergebnisse zu erzielen, wird empfohlen, die Zellen um nicht mehr als 25 % zu verdünnen.

2) Wechseln Sie das Screeningmedium, das Medikamente enthält, alle 3–4 Tage.

3) Messen Sie die Zellkoloniebildung nach 7 Tagen Screening. Die Koloniebildung kann je nach Wirtszelltyp, Transfektion und Screeningeffektivität eine weitere Woche oder länger dauern.

4) 5–10 resistente Klone wurden ausgewählt, auf 35-mm-Zellkulturplatten übertragen und 7 Tage lang mit medikamentenhaltigem Screeningmedium kultiviert.

5) Durch normales Medium ersetzen.

Unterlagen:

Sicherheitsdatenblatt

60220_MSDS_HB220421_DE.pdf

Benutzerhandbücher

60220_Handbuch_HB250115_DE.pdf

Zahlen

Abbildung 1.Stabilitätstest und Validierung der wirksamen Konzentration von Genomycin zwischen verschiedenen Chargen

Experimenteller Stamm: E. coli

G69 und G99 sind zwei verschiedene Chargen

Die Verwendungskonzentration von Genomycin wurde auf 8 mg/l, 12 mg/l bzw. 16 mg/l festgelegt, und die wirksame Mindestkonzentration wurde auf 16 mg/l festgelegt, was das Wachstum verschiedener Bakterien perfekt hemmte. Die Leistung der beiden Chargen war konsistent.