Hygromycin B, ein von Streptomyces hygroscopicus synthetisiertes Aminoglykosid-Antibiotikum, hemmt die Proteinsynthese, indem es die 70S-Ribosomentranslokation stört und ein Fehllesen der mRNA-Vorlage verursacht und so Prokaryoten (wie Bakterien), Eukaryoten (wie Hefen, Pilze) und Eukaryoten höherer Säugetiere tötet.

Hygromycin-Resistenzgene (hyg oder hph) aus Escherichia coli kodieren Hygromycin-B-Phosphotransferase, die Hygromycin B in ein nicht biologisch aktives phosphoryliertes Produkt entgiftet, was es zu einem hervorragenden selektiven Marker für das Screening und die Kultivierung prokaryotischer oder eukaryotischer Zellen macht, die erfolgreich mit Hygromycin-Resistenzgenen transfiziert wurden. Darüber hinaus wird Hygromycin B aufgrund unterschiedlicher Wirkungsweisen häufig in Kombination mit G418 oder Blasticidin S zur Auswahl dualresistenter Zelllinien verwendet. Hygromycin B kann auch als antivirales Mittel verwendet werden, da es selektiv in Zellen mit erhöhter Membrandurchlässigkeit aufgrund einer Virusinfektion eindringt und die Translation hemmt. Es kann auch als Insektenschutzmittel wirken, wenn es mit Tierfutter vermischt wird.

Darüber hinaus bietet die Firma Yeasen auch Hygromycin B (Kat.-Nr. 60224ES) in Lösungsform an, das in einem anderen Zustand vorliegt, aber die gleiche Funktion hat.

Merkmale

Standardisierte Produktion im Fabrik-Massenproduktionsmodus

Anwendungen

Screening stabil transfizierter Zelllinien

Technische Daten

Komponenten

Versand und Lagerung

Der Hygromycin B Produkte sollten bei -15℃ ~ -25℃ für 2 Jahre.

Anweisungen

1. Herstellung der Stammlösung (50 mg/mL)

Wiegen Sie 0,5 g Hygromycin B ab und geben Sie es zu 10 mL 1×PBS, pH 7,4. Nach gründlicher Auflösung durch ein 0,22 μm Filter zum Sterilisieren. In kleine Mengen für den einmaligen Gebrauch (z. B. 1 ml) aliquotieren und bei -25 bis -15 lagern.℃oder 2 Zu 8℃.

2. Häufig verwendete Screening-Konzentration

Die Arbeitskonzentration von Hygromycin B, die zum Screening stabiler Transferstämme verwendet wird, muss je nach Zelltyp, Medium, Wachstumsbedingungen und Zellstoffwechselrate variieren. Empfohlene Konzentrationen liegen zwischen 50 und 1000 μg/mL. Für das erste experimentelle System wird eine Abtötungskurve (Kill Curve), die Dosis-Reaktivitätskurve, empfohlen, um die optimale Screening-Konzentration zu bestimmen.

Im Allgemeinen Säugetierzellen: 50-500 μg/mL; Bakterien-/Pflanzenzellen: 20-200 μg/ml; Pilze: 300-1000 μg/ml.

3. Festlegung der Abtötungskurve

Hinweis: Um stabile Zelllinien zu screenen, ist es notwendig, die Mindestkonzentration an Antibiotika zu bestimmen, die in der Lage ist, nicht transfizierte Wirtszellen abzutöten. Dies kann durch die Erstellung einer Abtötungskurve (Dosis-Wirkungs-Kurve) erreicht werden. Es sollten mindestens fünf Konzentrationen festgelegt werden.

1) Tag 1: Nicht-transformierte Zellen werden in einer geeigneten Kulturplatte mit einer Zelldichte von 20–25 % ausgesät und über Nacht kultiviert.

Hinweis: Die Anzahl der Inokulationszellen kann für Zellen erhöht werden, deren Vitalitätsnachweis eine höhere Dichte erfordert.

2) Stellen Sie den Konzentrationsgradienten je nach Zelltyp im entsprechenden Bereich ein.Säugetierzellen können 50, 100, 250, 500, 750, 1000 μg/ml. Verdünnen Sie die Hygromycin B-Lösung 1:10 mit deionisiertem Wasser oder PBS-Puffer auf 5 mg/ml. Und verdünnen Sie die Lösung dann gemäß der folgenden Tabelle auf die entsprechende Arbeitskonzentration.

3) Tag 2: Ersetzen Sie es durch ein frisch zubereitetes Medium mit der entsprechenden Konzentration des Arzneimittels. Machen Sie für jede Konzentration drei parallele Proben.

4) Anschließend alle 3–4 Tage durch frisches, das Arzneimittel enthaltendes Medium ersetzen.

5) Führen Sie in festgelegten Abständen (z. B. alle 2 Tage) Lebendzellzählungen durch, um die geeignete Konzentration zu ermitteln, die das Wachstum nicht transfizierter Zellen hemmt. Wählen Sie die niedrigste Konzentration, die die überwiegende Mehrheit der Zellen innerhalb der idealen Anzahl von Tagen (normalerweise 7-10 Tage) abtöten kann, als Arbeitskonzentration für die Auswahl stabiler Transfektanten.

4. Screening stabil transfizierter Säugetierzelllinien

1) 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mittels Screeningmedium, das Hygromycin B in geeigneter Konzentration (direkt oder verdünnt) enthielt, subkultiviert.

Hinweis: Antibiotika wirken am besten bei sich teilenden Zellen. Wenn die Zellen zu dicht sind, tötet das Antibiotikum sie nicht ab. Teilen Sie die Zellen so, dass sie nicht mehr als zu 25 % konfluent sind.

2) Wechseln Sie das Screening-Medium alle 3–4 Tage.

3) Messen Sie die Zellkoloniebildung nach 7 Tagen Screening. Die Koloniebildung kann je nach Wirtszelltyp, Transfektion und Screeningeffektivität eine weitere Woche oder länger dauern.

4) Wählen Sie 5–10 resistente Klone aus, übertragen Sie sie auf 35-mm-Zellkulturplatten und kultivieren Sie sie 7 Tage lang mit einem wirkstoffhaltigen Screeningmedium.

5) Durch frisches Medium ohne Arzneimittel für die Kultur ersetzen.

Unterlagen:

Sicherheitsdatenblatt

60225_MSDS_HB220420_DE.pdf

Benutzerhandbücher

60225_Handbuch_HB250115_DE.pdf