Aureobasidin A, auch bekannt als AbA, Basifungin, Breomycin A, ist ein zyklisches Esterpeptid-Antibiotikum, das aus dem filamentösen Pilz Aureobasidium Pullulans Nr. R106 isoliert wird. Es hat eine starke antimykotische Wirkung und ist ein Inhibitor der inositolphosphorylierten Ceramidsynthase AUR1. Es ist bereits in niedrigeren Konzentrationen (0,1–0,5 μg/ml) toxisch für Hefen. Zu den Pilzarten, die für Aureobasidin A anfällig sind, gehören Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharces pombe, Candida glabrata, Aspergillus nidulans und A. niger. Zu den Pilzarten, die dafür anfällig sind, gehören Zahnhefe (Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces pombe, Candida glabrata (Candida glabrata), Aspergillus nest (Aspergillus nidulans) und Aspergillus niger (A. niger.). Der Wirkungsmechanismus besteht darin, dass Aureobasidin A die Aktivität der Inositolphosphoramidit-Synthase (Inositolphosphorylceramid, IPC) hemmt, von der das Pilzwachstum abhängig ist, und die Sphingolipidsynthese stört, wodurch der Stamm weiter abgetötet wird. Weitere Gene, die IPC-Synthasen kodieren, wurden untersucht, wie das AUR 1-Gen von Saccharomyces cerevisiae und das AURA-Gen von A. sinensis, das Homologie aufweist. Die Stummschaltung dieser kodierenden Gene macht die Stämme resistent gegen Aureobasidin A, wie etwa das AUR 1-C-Gen.

Aureobasidin A eignet sich hervorragend als Wirkstoffselektionsmarker zum Screening positiver Klone. Aureobasidin A-Resistenz ist auch ein idealer Reporter in Hefe-Einzelhybrid- und -Zweihybridstudien. Dieses Produkt ist eine Lösung von Aureobasidin A in Methanol mit einer Konzentration von 1 mg/ml.

Merkmale

Reinheit≥97 %

Standardisierte Produktion im Fabrik-Massenproduktionsmodus

Anwendungen

Hefe-Zwei-Hybrid-Studien

Hefe-Ein-Hybrid-Studien

Rigoroser Hefe-Medikamentenauswahlmarker

Aureobasidin A-Resistenz ist ein idealer Reporter für Hefe-Hybridisierungsstudien

Technische Daten

Komponenten

Versand und Lagerung

Der Aureobasidin A（AbA） Produkte sollten bei -15℃ ~ -25℃ für 2 Jahre.

Anweisungen

1. Arbeitskonzentration

Informationen zur spezifischen Konzentration finden Sie in der entsprechenden Literatur. Prüfen und optimieren Sie diese entsprechend Ihren eigenen Versuchsbedingungen (wie Versuchszweck, Zelltyp, Kultureigenschaften usw.).

2. Zellexperiment (In-vitro-Experiment)

Aureobasidin A hemmt das Wachstum von Hefezellen durch Ceramidvergiftung und Entzug essentieller Inositolphosphorylceramide^[1].

Dreifache Tandemwiederholungen jedes CArG-Box-Motivs wurden synthetisiert. Alle DNA-Fragmente wurden unter Verwendung geeigneter Restriktionsstellen in den Y1H-Vektor pAbAi (Clontech, Mountain View, USA) kloniert. Anschließend wurde jedes zusammengesetzte pAbAi-Konstrukt mit BstbI linearisiert und gemäß dem Handbuch „Yeast Transformation System 2“ (Clontech, Mountain View, USA) in den Stamm Saccharomyces cerevisiae Y1HGold transformiert. Klone, die das gewünschte DNA-Fragment trugen, wurden auf Autoaktivierung auf synthetischem Uracil-Dropout-Medium, ergänzt mit Aureobasidin A in einer Konzentration von 100, aufgefüllt.–900 ng/ml, wie angegeben (Clontech, Mountain View, USA)^[2].

Die offenen Leserahmen (ORFs) der SlBES1-Gene wurden amplifiziert und in das pGBKT7-GAL4BD-Plasmid ligiert. Die Fusionskonstrukte GAL4BD-SlBES1 wurden anschließend in Y2H Gold-Hefezellen transformiert. Die SD/−Zur Kultivierung der Hefetransformanten wurden Trp-Mediumplatten verwendet.Der αDie -Galactosidase-Aktivität der Transformanten wurde durch X-α-gal und die Expression von AUR1-C wurde durch Aureobasidin A gescreent^[3].

3. Minimale Hemmkonzentrationen von Aureobasidin für verschiedene Hefen

4. Betriebsverfahren (für Hefe-Transformationssysteme mit Resistenz gegen AbA)

1) Geben Sie 0,5 ml der über Nacht gereiften Hefekultur zu 50 ml YPD-Medium hinzu (Zusammensetzung: 1 l Flüssigmedium enthält 10 g Hefeextrakt, 20 g Polypepton, 20 g D-Glucose; für festes Medium fügen Sie zusätzlich 2 % Agar hinzu).

2) Inkubieren bei 30℃ für etwa 6 Stunden, bis der OD660-Wert 1-2 beträgt. Bei Verwendung von Diploiden beträgt der OD660-Wert 2-4.

3) Zentrifugieren bei 1.000×g für 5 Minuten.

4) Das Pellet wird in 10 mL Lösung A (Zusammensetzung: 100 mM Lithiumacetat, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA) resuspendiert und anschließend bei 1.000×g für 5 Minuten.

5) ESuspendieren Sie das Pellet in Lösung A, bis der OD660 150 beträgt.

6) 100 µL der Zellsuspension in ein Röhrchen geben und bei 30℃ für 1 Stunde.

7) Fügen Sie 5 µg des Vektors (zirkuläre oder lineare DNA) und 150 µg Träger-DNA (die auf 100℃ 10 Minuten garen und dann schnell abkühlen lassen).

Hinweis: pAUR101 erfordert lineare DNA zur Transformation. Die Verwendung zirkulärer DNA verringert die Transformationseffizienz oder kann sogar fehlschlagen. pAUR112 und pAUR123 erfordern vollständige Plasmid-DNA zur Transformation.

8) 850 µl Lösung B hinzufügen (Zusammensetzung: 40 g Polyethylenglykol 4000 in 100 ml Lösung A auflösen und gut vermischen, vor Gebrauch frisch zubereiten) und vorsichtig vermischen.

9) Inkubieren bei 30℃ für 30 Minuten, dann bei 42℃ für 15 Minuten.

10) 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen.

11) Zentrifugieren Sie es 1 Minute lang bei 5.000 U/min und resuspendieren Sie das Pellet in 5 ml YPD-Medium.

12) Inkubieren bei 30℃ 6 Stunden bis über Nacht.

13) Bei 5.000–10.000 U/min zentrifugieren und das Pellet in 1–10 ml 0,9 % NaCl resuspendieren.

14) Geben Sie 100 µL der Zellsuspension auf YPD-Selektivmediumplatten (die je nach Stammtyp eine bestimmte Konzentration an AbA enthalten).Inkubieren bei 30℃ für 3–4 Tage, bis die Umwandlung abgeschlossen ist.

15) Wählen Sie positive Transformanten aus und/oder bestimmen Sie die Transformationseffizienz (ausgedrückt als Anzahl der transformierten Kolonien pro Mikrogramm Plasmid-DNA).

Unterlagen:

Sicherheitsdatenblatt

60231_MSDS_HB220420_DE.pdf

Benutzerhandbücher

60231_Handbuch_HB250116_DE.pdf

Zahlen

Abbildung 1. Wachstumsdiagramm für Hefeplatten

Experimenteller Stamm:GS115

Verbrauchsmenge: 0,05 μg/ml、0,1 μg/ml、0,5 μg/ml、1 μg/ml

Behandlung: 3-5 Tags bei 30℃

Die obere Reihe ist das Yeasen-Produkt und die untere Reihe ist die Marke T*.