¿Qué enzimas utilizan los científicos para unir un nuevo gen? No hace falta decir que se incluye la ADN ligasa. Entonces, ¿por qué es tan importante la ADN ligasa en el ADN recombinante? Porque la ADN ligasa es responsable de ligar el fragmento diana al vector, que es uno de los elementos clave que determinan el éxito del experimento. Como tipo de ADN ligasa, ¿qué papel desempeña la ADN ligasa T4 en los experimentos de clonación molecular? ¿Cómo funciona? A continuación, presentaremos en detalle la ADN ligasa T4.

1. ¿Qué es la ADN ligasa T4?
2. ¿Cuál es la función de la ADN ligasa T4?
3. La ligasa de ADN T4 de Yeasen Biotech se puede utilizar para la ligadura del adaptador NGS
4. Guía de selección de la ligasa de ADN T4 de Yeasen Biotech

1. ¿Qué es la ADN ligasa T4?

La ADN ligasa T4 es una ligasa dependiente de ATP que cataliza la reacción de ligación entre moléculas de ADN. Forma principalmente fosfodiésteres mediante la unión de los extremos 3'-hidroxilo y 5'-fosfato. Las ADN ligasas participan en los procesos de replicación y reparación del ADN en todos los organismos. La ADN ligasa T4 codificada por fagos se produce durante la infección de E. coli por fagos T4.
Las ligasas utilizadas en ingeniería genética son principalmente la ligasa de ADN de E. coli y la ligasa de ADN T4, siendo esta última la más utilizada en la actualidad. La ligasa de ADN T4 puede reparar cortes monocatenarios en ADN bicatenario, ARN bicatenario o cadenas híbridas de ADN/ARN para conectar dos nucleótidos adyacentes, y desempeña un papel importante en la reparación y recombinación del ADN.
En el proceso de construcción de plásmidos recombinantes, la ADN ligasa T4 se puede utilizar junto con enzimas de restricción para completar el experimento de construcción de plásmidos recombinantes. Puede catalizar la formación de un enlace fosfodiéster entre el extremo 5'-P y el extremo 3'-OH del ADN bicatenario y tiene una buena eficiencia de conexión para la conexión de extremos pegajosos y romos.

Figura 1. Mecanismo de la ligasa de ADN T4

2. ¿Cuál es la función de la ADN ligasa T4?

2.1 Construcción de vectores

En los experimentos de construcción de vectores, diferentes enzimas de restricción pueden producir distintos tipos de extremos. Para los distintos extremos, la ADN ligasa T4 tendrá diferentes estrategias de ligación.

2.1.1 Clonación con enzimas de restricción, extremos pegajosos producidos por digestión única

Durante la construcción del vector, si se utiliza la misma endonucleasa de restricción para cortar el fragmento de ADN del gen diana y la molécula del vector puede producir el mismo extremo pegajoso, la ligasa de ADN T4 puede llevar a cabo directamente la conexión de recombinación. Sin embargo, debido a que los extremos pegajosos son los mismos, el gen diana se puede insertar en el vector en la dirección directa o inversa, lo que aumentará fácilmente la carga de trabajo de selección de clones recombinantes correctos. Considere utilizar el método de digestión con doble enzima para la construcción del vector.
Además, los extremos cohesivos del vector preparado mediante digestión con una sola enzima también se pueden aparear, y luego se forman enlaces fosfodiéster entre nucleótidos bajo la acción de la ADN ligasa T4, lo que da como resultado la autoligación del vector. El uso de fosfatasa alcalina para tratar el vector digerido puede eliminar el grupo fosfato en el extremo 5' del vector de modo que el vector no pueda completar la autoligación. Por lo tanto, bajo la acción de la ADN ligasa T4, el vector y el fragmento diana se conectan para completar la construcción del vector recombinante.

2.1.2 Clonación con enzimas de restricción, extremos pegajosos producidos por digestión doble

En el proceso de construcción del vector, si se utilizan dos enzimas de restricción con diferentes extremos pegajosos para digerir el fragmento diana y el vector respectivamente, se pueden generar dos extremos pegajosos diferentes. En este punto, la ADN ligasa T4 puede ligar selectivamente los mismos extremos pegajosos para garantizar que el fragmento diana se inserte en el vector en la dirección correcta. Cuando el fragmento diana y el vector en la Figura 2 se digieren con EcoR I y BamH I al mismo tiempo, se pueden conectar los mismos extremos pegajosos. Solo hay una dirección de ligación entre el fragmento diana y el vector.

Figura 2. Ligadura de extremos pegajosos generada por digestión con doble enzima^[1]

2.1.3 Clonación de fragmentos de restricción, extremo romo

Algunas endonucleasas de restricción también pueden generar extremos romos durante las escisiones enzimáticas, como Sma I y otras. La ligasa de ADN T4 puede formar directamente un enlace fosfodiéster entre el vector y el inserto, y no hay necesidad de emparejamiento entre bases. Sin embargo, este método tiene una baja eficiencia de ligación y es propenso a la autoligación del vector. Generalmente, los extremos romos se pueden convertir en extremos pegajosos y luego ligarse. Por ejemplo, agregar bases poli A y poli T complementarias a los extremos del fragmento objetivo y el vector y extremos complementarios pegajosos artificialmente respectivamente mejoran la eficiencia de conexión por la desoxinucleotidil transferasa terminal.

2.1.4 Clonación TA

El vector T utilizado en la clonación TA tiene un saliente T en el extremo 3'. Cuando la secuencia de ADN del fragmento diana no está clara, el fragmento del gen diana se puede conectar al vector T mediante la clonación TA, y el gen diana se puede determinar mediante secuenciación. La ADN polimerasa Taq utilizada en PCR tiene actividad de transferasa terminal y puede añadir un nucleótido "A" al extremo 3' del fragmento de ADN. La ADN ligasa T4 puede conectar directamente el producto amplificado por la ADN polimerasa Taq al vector T, y el producto amplificado por PCR puede lograr el propósito de una clonación eficiente sin añadir adaptadores artificiales.

Figura 3. El flujo de trabajo de la clonación de TA^[2]

2.2 Ligadura del adaptador NGS

Durante la construcción de la biblioteca de secuenciación de próxima generación, es necesario conectar el adaptador artificial al producto de PCR antes de que pueda fijarse en la celda de flujo en el chip de secuenciación para completar la secuenciación. La construcción de la biblioteca de ligadura de clonación TA es un medio técnico muy común, y su principio es similar al de la clonación TA mencionada anteriormente. Después de que el fragmento de ADN que se va a secuenciar se fosforila en el extremo 5' y se agrega "A" en el extremo 3', es complementario y se empareja con el adaptador con el extremo adhesivo "T". Luego, la máquina forma y secuencia la doble hebra completa.
Durante la ligadura de TA, los diferentes tipos de muestras o la complejidad de la estructura del fragmento de ácido nucleico afectarán la eficiencia de la ligadura, por lo que los adaptadores de diferentes plataformas también tendrán un impacto en el resultado final de la biblioteca.
Por ejemplo, el adaptador Bubble de la plataforma MGI tiene una estructura secundaria especial y requiere una eficiencia de ligadura muy alta para la ligasa de ADN T4, y la reducción de la eficiencia de ligadura afecta directamente el resultado de la biblioteca.

Figura 4. Proceso general de ligadura del adaptador

3.La ligasa de ADN T4 de Yeasen Biotech se puede utilizar para la ligadura del adaptador NGS

Yeasen Biotech desarrolló especialmente Ligasa de ADN T4 rápida para la ligadura de fragmentos de ADN y adaptadores en el proceso de construcción de la biblioteca NGS. La enzima tiene una capacidad de ligadura eficiente, no solo una velocidad de conexión rápida sino también compatible con varios tipos de muestras, lo que es más ventajoso para la conexión de fragmentos de ácido nucleico con estructuras complejas. En la actualidad, se ha verificado mediante la secuenciación de alto rendimiento de una gran cantidad de clientes. Para la conexión de adaptadores Bubble en la plataforma MGI, también se puede obtener una excelente calidad de secuenciación.

3.1 Ligasa de ADN T4 rápida de Yeasen Biotech con una eficiencia de ligación ultraalta

Utilice la ligasa de ADN Fast T4 de Yeasen Biotech para construir bibliotecas con diferentes tipos de adaptadores. La muestra es un imitador de cfDNA de 170 pb y se utiliza la biblioteca Agilent 2100 para detectar los resultados. ① Producto adaptador no conectado; ② Producto adaptador de un solo extremo; ③ Producto adaptador de doble extremo; ④ Adaptador residual. A partir de los resultados, se puede ver que la eficiencia de ligación de los adaptadores de un solo extremo y de doble extremo es muy alta.

Figura 5. Diferentes tipos de productos de ligación detectados por el Agilent 2100

3.2 Ligasa de ADN T4 rápida de Yeasen Biotech con excelente rendimiento de biblioteca

Al utilizar la ligasa de ADN T4 rápida para diferentes tipos de construcción de bibliotecas, en comparación con otras ligasas de ADN T4, los rendimientos de las bibliotecas son mejores.

Tabla 1. Rendimiento de las bibliotecas de diferentes tipos de muestras

4. Guía de selección de la ligasa de ADN T4 de Yeasen Biotech

Yeasen es una empresa de biotecnología dedicada a la investigación, desarrollo, producción y venta de tres reactivos biológicos principales: moléculas, proteínas y células. Además de la ligasa de ADN Fast T4, Yeasen Biotech también tiene Nueva ligasa de ADN T4 y Ligasa rápida de ADN T4 para elegir. Puede elegirlos en función de las aplicaciones que se muestran en la siguiente tabla:

Tabla 2: Productos relacionados

Referencias

[1] W. Yuan. Ingeniería genética[M]. Prensa de la industria química, 2019.
[2] Clark DP, Pazdernik NJ, Mcgehee M R. Clonación de genes para biología sintética - ScienceDirect[J]. Biología molecular (tercera edición), 2019:199-239.
[3] Tomkinson AE, Vijayakumar S, Pascal JM, et al. Ligasas de ADN: estructura, mecanismo de reacción y función[J]. Chemical Reviews, 2006, 106(2):687-699.
[4] Shuman S. Ligasas de ADN: progreso y perspectivas[J]. Revista de química biológica, 2009, 284(26):17365-17369.