La desoxirribonucleasa I (DNasa I) es una endonucleasa, cuya aplicación no es solo para mantener la integridad del ARN sino también para el análisis de la huella de ADN, la generación de bibliotecas de ADN aleatorias, la reducción de la adhesividad en lisados ​​celulares o extractos de proteínas, etc. En una palabra, la DNasa I se puede utilizar en casi cualquier aplicación que requiera escisiones enzimáticas del ADN. A continuación se presenta una introducción detallada a la DNasa I y su aplicación específica.

1. ¿Qué es la DNasa I?
2. DNasa I para la preparación de extracción de ARN sin ADN
3. DNasa I para la transcripción in vitro para eliminar el ADN molde
4. DNasa I para la eliminación del ARNr
5. DNasa I para el etiquetado del ADN
6. Otras aplicaciones
7. Guía de selección de productos de DNasa I

1. ¿Qué es la DNasa I?

Desoxirribonucleasa I (DNasa I) es una endonucleasa no específica que puede digerir ADN monocatenario o bicatenario, presente en diferentes tejidos y fluidos corporales. Puede hidrolizar enlaces fosfodiéster para producir mono y oligodesoxinucleótidos que contienen un grupo 5'-fosfato y un grupo 3'-OH. El rango de pH de trabajo óptimo de la DNasa I es 7-8, su actividad depende de Ca2+ y puede ser activada por iones metálicos divalentes como Mn2+, Mg2+, Zn2+, etc. En presencia de Mg2+, la DNasa I corta aleatoriamente cualquier sitio de ADN bicatenario; en presencia de Mn2+, la DNasa I puede cortar ADN bicatenario en el mismo sitio para formar un extremo romo o extremos pegajosos de 1-2 nucleótidos.

Figura 1. Diagrama esquemático de la escisión del dsADN por la DNasa I en presencia de Mg2+ y Mn2+.

Aunque las escisiones de la DNasa I se consideran generalmente escisiones no específicas, es más probable que actúe sobre ciertos fragmentos de secuencia, como la región del surco menor, y es más propensa a escindir secuencias de purina-pirimidina. Sin embargo, cuando la DNasa I actúa sobre dsADN heterogéneo, se escindirán las cuatro bases y el efecto sobre una base específica no será más de 3 veces mayor que el de otras bases.

2. DNasa I para la preparación de extracción de ARN sin ADN

En los experimentos biológicos, el primer paso es preparar el ácido nucleico para estudiar las distintas funciones del ARN. Sin embargo, dado que el ADN y el ARN suelen liberarse juntos durante el proceso de lisis celular, la interferencia entre ambos no se puede evitar sin importar qué solución de extracción se utilice, por lo que se deben utilizar enzimas específicas para eliminar la interferencia. Para una extracción de ARN de alta calidad, se utiliza la DNasa I para eliminar el ADN residual de la muestra.

La DNasa I puede degradar el ADN bicatenario y monocatenario en oligonucleótidos y nucleótidos simples, y el ADN en el producto de preparación del ARN puede degradarse de manera efectiva. Luego, la DNasa I se inactiva mediante calentamiento con un tampón de parada. Durante el proceso de calentamiento, se puede abrir la estructura de horquilla de la molécula de ARN, lo que facilita la entrada directa del ARN en el proceso de transcripción inversa.
La calidad del ARN afectará directamente a los datos experimentales en gran medida. En general, los residuos de ADN genómico no se pueden evitar por completo durante la extracción de ARN, por lo tanto, generalmente se recomienda tratar las muestras de ARN con DNasa I para digerir el ADN genómico residual antes de realizar aplicaciones posteriores (por ejemplo, análisis de expresión de ARNm, análisis de transcriptoma, etc.). El paso de digestión del ADN genómico se puede realizar durante la extracción de ARN, después de la extracción de ARN o antes de la transcripción inversa del ARN.Según el posicionamiento del producto, los productos que ofrece Yeasen son los siguientes:

Tabla 1: Lista de productos relacionados con la eliminación de ADN o la extracción de ARN o antes de la transcripción inversa

3. DNasa I para la transcripción in vitro para eliminar el ADN molde

La transcripción in vitro (IVT) utiliza principalmente ADN como plantilla, además de los sustratos y tampones correspondientes para obtener ARN mediante la transcripción in vitro. En los experimentos de transcripción in vitro, las ARN polimerasas como T7, T3 y SP6 se ​​utilizan comúnmente para la síntesis de ARN. El ARN sintetizado puede tener residuos de ADN. La eliminación de los residuos de ADN es beneficiosa para el desarrollo de experimentos posteriores. Por ejemplo, en la etapa de desarrollo de la vacuna de ARNm, la eliminación de residuos es un paso crítico, que puede reducir la dificultad de la purificación posterior y aumentar la pureza del producto. La plantilla de ADN se elimina típicamente utilizando ADNasa I recombinante (libre de ARNasa).Según el proceso de síntesis de ARNm, los productos proporcionados por Yeasen son los siguientes: