La tecnología de amplificación isotérmica puede lograr el objetivo de amplificar secuencias específicas de ácidos nucleicos en condiciones de temperatura constante. Debido a que no requiere equipos especiales, el tiempo de amplificación es corto y la sensibilidad es alta, ha demostrado tener buenas perspectivas de aplicación en la detección in situ y el diagnóstico en el punto de atención y es muy adecuada para el desarrollo de herramientas de diagnóstico molecular.

En el contexto de la pandemia del nuevo coronavirus con cepas y capacidad de infección en aumento, la tecnología de amplificación isotérmica puede detectar el nuevo coronavirus rápidamente con instrumentos simples, ayudando a resolver el problema de que algunos pacientes con COVID-19 no pueden confirmarse rápidamente debido al largo tiempo de detección y los altos requisitos de equipos de detección y reactivos de las técnicas de PCR tradicionales. ¿Cuál es entonces el principio de la RT-LAMP, una de las técnicas de amplificación isotérmica? ¿Cuáles son las materias primas de alta calidad que puede proporcionar Yeasen?

1. ¿Cuál es el principio de RT-LAMP?
2. Diseño de primer para RT-LAMP
3. ¿Qué materias primas puede proporcionar Yeasen?
4. Guía de selección de productos

1. ¿Cuál es el principio de RT-LAMP?

En el año 2000, los académicos japoneses Notomi y otros establecieron una nueva tecnología de amplificación de ácidos nucleicos llamada amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP). LAMP utiliza 4 cebadores específicos diseñados para 6 regiones del gen objetivo y utiliza la ADN polimerasa de desplazamiento de cadena para amplificar 109 copias de la secuencia objetivo en decenas de minutos en condiciones isotérmicas (60～65 ℃). Los resultados se juzgaron mediante electroforesis en gel de agarosa y los resultados positivos mostraron bandas en forma de escalera. LAMP tiene las características de fuerte especificidad, alta sensibilidad, operación rápida y simple y bajo costo. Con la mejora y el perfeccionamiento continuos de esta tecnología, actualmente se utiliza en la detección de varios microorganismos patógenos.

RT-LAMP es un método en el que se añade transcriptasa inversa al sistema de amplificación LAMP, lo que permite la detección directa del ARN viral. La eficiencia de amplificación de LAMP es extremadamente alta, por lo que se puede amplificar una gran cantidad de ácido nucleico con solo una pequeña cantidad de ADNc. Se ahorra el tiempo de transcripción inversa en el proceso de amplificación de ácidos nucleicos y se acelera la velocidad de detección del ARN.

El ADN se encuentra en un estado de equilibrio dinámico a unos 65 ℃. Bajo la acción de la ADN polimerasa de desplazamiento de hebra, a partir del extremo 3' del segmento F2 del cebador FIP, se empareja con la secuencia complementaria del ADN molde para iniciar la síntesis de ADN por desplazamiento de hebra. El cebador F3 es complementario a F3c en el extremo delantero de F2c y toma el extremo 3' como punto de partida para sintetizar su ADN mientras reemplaza la hebra de ADN sintetizada por el cebador FIP líder por la acción de una ADN polimerasa de desplazamiento de hebra. Extender hacia adelante. La hebra de ADN sintetizada por el cebador F3 final forma una doble hebra con una hebra de ADN molde. La hebra de ADN sintetizada por el cebador FIP se reemplaza por la hebra del cebador F3 para generar una hebra simple. Esta hebra simple tiene segmentos F1c y F1 complementarios en el extremo 5', por lo que se realiza el apareamiento de bases propias para formar una estructura circular. Y el cebador BIP se hibrida y se combina con la cadena sencilla, y el extremo 3' del cebador BIP se utiliza como punto de partida para sintetizar una cadena complementaria, y la estructura se abre en el proceso.Luego, se insertan cebadores similares a F3 y B3 a partir del cebador BIP, se realiza el apareamiento complementario de bases y se sintetiza una nueva cadena complementaria a partir del extremo 3' como punto de partida. Existen secuencias complementarias en ambos extremos del ADN monocatenario reemplazado y se produce el apareamiento de bases propias para formar una estructura circular, por lo que toda la cadena presenta una estructura tipo mancuerna. Esta estructura es la estructura de partida del ciclo de amplificación del método RT-LAMP.

En la estructura en forma de mancuerna, la extensión del ADN se lleva a cabo utilizando el segmento F1 en el extremo 3' como punto de partida y utilizándose a sí mismo como plantilla. Y el cebador FIP F2 se hibrida con el F2c monocatenario en el bucle para iniciar una nueva ronda de reacción de desplazamiento de cadena. El ácido nucleico bicatenario sintetizado a partir del segmento F1 se disocia y, de manera similar, se forma una estructura circular en el ácido nucleico. Hay una forma monocatenaria de B2c en la estructura circular, y B2 en el cebador BIP se hibrida con él para iniciar una nueva ronda de amplificación, y se forma una estructura circular a través del mismo proceso. De acuerdo con este proceso, las secuencias complementarias en la misma cadena pasan por ciclos de apareamiento, extensión de cadena y finalmente forman estructuras de diferentes tamaños.

2. Diseño de primer para RT-LAMP

El diseño del cebador es la clave para la amplificación y detección exitosa de RT-LAMP. Los cebadores RT-LAMP incluyen dos cebadores externos (F3 y B3) y dos cebadores internos (FIP y BIP). Cebador F3: el cebador externo aguas arriba, que consiste en la región F3, es complementario a la región F3c del gen diana. Cebador FIP: cebador interno aguas arriba, que consiste en la región F2, la región F2c en el extremo 3' del gen diana en la región F2 es complementaria a la región F1c en el extremo 5' del gen diana. Cebador BIP: cebador interno aguas abajo, compuesto por la región B2, la región B2 es complementaria a la región B2c en el extremo 3' del gen diana, y tiene la misma secuencia que la región B1c en el extremo 5' del gen diana.

De manera similar a la PCR, los principios de diseño de cebadores deben prestar atención a factores como la composición de bases, el contenido de GC y la subestructura. Además, se deben tener en cuenta los siguientes puntos. Las porciones del extremo 5' de los cebadores internos FIP y BIP, es decir, F1c y B1c, tienen generalmente una longitud de 8-50 pb. La longitud es preferiblemente de 15 a 25 pb, y el valor de Tm es mayor que los valores de Tm de F2 y B2 en la porción del extremo 3'. Las porciones del extremo 3' de los cebadores internos FIP y BIP, es decir, F2 y B2, tienen generalmente una longitud de 8-50 pb. La longitud es preferiblemente de 15-25 pb, y el valor de Tm es consistente con la temperatura óptima de la ADN polimerasa Bst seleccionada en el experimento. Las longitudes de los cebadores externos F3 y B3 son generalmente de 8-50 pb. La longitud es preferiblemente de 15-25 pb, y su valor de Tm es menor que el de F2 y B2. Al diseñar los cebadores, se debe tener en cuenta la estructura del bucle y el tamaño de la secuencia diana. Cuando el número de bases en el bucle es mayor de 40 pb y el tamaño de la secuencia diana es de 130-200 pb, la eficiencia de amplificación es máxima.

3. ¿Qué materias primas puede proporcionar Yeasen?

3.1 [Nueva actualización] Yeasen Bst Más ADN polimerasa

El recién actualizado ADN polimerasa Hieff™ Bst Plus (Cat. n.° 14402ES, 14403ES) Se obtiene expresando y purificando el gen de la ADN polimerasa de Bacillus stearothermophilus. es carente del dominio exonucleasa 5′→3′ en E. coli.La capacidad de desplazamiento de la cadena enzimática es fuerte y tiene las ventajas de alta sensibilidad, alta eficiencia de amplificación y alta tolerancia a dUTP, y puede usarse ampliamente en la detección en tiempo real de patógenos basada en tecnología de amplificación isotérmica.

3.1.1 Rapidez y alta sensibilidad

La ADN polimerasa Yeasen Hieff™ Bst Plus tiene una alta sensibilidad y puede detectar el gen objetivo en tan solo 5 copias. La cantidad de plantilla se encuentra en el nivel de femtogramos (fg) y la tasa de amplificación es más rápida que la de los productos de la competencia.

Figura 1. La reacción RT-LAMP se llevó a cabo con Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA Polymerase (naranja) y enzimas Bst del competidor N (gris) y del competidor T (azul) para amplificar el SARS-CoV-2. Los resultados muestran que la Hieff™ Bst Plus DNA Polymerase de Yeasen siempre puede alcanzar el umbral más rápido que los productos de la competencia y la tasa de amplificación es más rápida.

4. Guía de selección de productos

Los productos proporcionados por Yeasen son los siguientes:

Tabla 1.Información del producto