El anticuerpo de ADN polimerasa anti-Taq de doble bloque para ayudar a reducir la amplificación inespecífica

El diagnóstico molecular es el subcampo de más rápido desarrollo en el campo del diagnóstico in vitro. Tiene las ventajas de un tiempo de detección corto, una alta sensibilidad y una fuerte especificidad. Se utiliza ampliamente en el diagnóstico concomitante de tumores y en la detección de enfermedades infecciosas y genéticas. En el campo del diagnóstico molecular, la PCR no solo es la plataforma tecnológica más madura con la mayor participación de mercado, sino también la tecnología "estándar de oro" del diagnóstico clínico. En la reacción de PCR tradicional, a menudo se produce el problema de la amplificación inespecífica. La amplificación inespecífica afecta directamente la interpretación de los resultados de la detección y conducirá a la disminución de la sensibilidad de la amplificación e incluso al rendimiento de los fragmentos diana. ¿Cómo se produce la amplificación inespecífica y cómo se puede evitar de forma eficaz?

1. La ADN polimerasa convencional puede provocar una amplificación no específica

2. La polimerasa de arranque en caliente puede mejorar la especificidad de la amplificación

3. El anticuerpo Taq de doble bloqueo puede mejorar al doble la especificidad y la estabilidad de la amplificación

4. Presentación del rendimiento del Taq de doble bloque de Yeasen anticuerpo

5. Información del producto

1. La ADN polimerasa convencional puede provocar una amplificación no específica

La escasa especificidad de la secuencia de los cebadores es la causa directa de la amplificación inespecífica. Como promotor de la ADN polimerasa convencional, su actividad exonucleasa puede truncar la secuencia del cebador de ADN durante la preparación del sistema de PCR, lo que reduce la especificidad de los cebadores.

Además, la ADN polimerasa convencional no solo tiene actividad exonucleasa sino que también tiene actividad polimerasa. Aunque la temperatura de extensión óptima de la ADN polimerasa es 72 ℃, la polimerasa sigue activa a temperatura ambiente. Por lo tanto, durante la preparación de la reacción de PCR y el proceso de calentamiento inicial, los cebadores pueden formar una unión no específica con algunas plantillas de cadena sencilla y extenderse bajo la acción de la ADN polimerasa Taq, lo que da como resultado la amplificación de secuencias no objetivo y afecta la especificidad de la reacción.

Por ello, los sistemas de PCR suelen configurarse en hielo para inhibir la actividad de la ADN polimerasa. Aunque este método es sencillo y barato, no puede inhibir por completo la actividad enzimática, por lo que no puede eliminar la amplificación de productos inespecíficos.

2. La polimerasa de arranque en caliente puede mejorar la especificidad de la amplificación

La polimerasa de inicio en caliente es el componente principal de la PCR de inicio en caliente. A temperatura ambiente, el sitio activo de la ADN polimerasa se bloquea mediante un modificador enzimático. Solo después de la desnaturalización por PCR a 95 ℃, el modificador enzimático se desprende y se inicia la actividad enzimática, lo que evita la amplificación no específica causada por la enzima.

En la actualidad, los métodos de modificación de la ADN polimerasa con inicio en caliente que se utilizan comúnmente en el mercado incluyen principalmente un método químico, un método de ligando y un método de anticuerpo. Entre ellos, el efecto de bloqueo de la polimerasa con inicio en caliente modificada con anticuerpo es el mejor y la velocidad de liberación de la actividad enzimática es rápida, lo que puede reducir en gran medida el tiempo de reacción de la PCR. Es un método de modificación de enzimas con inicio en caliente ampliamente utilizado en el mercado de IVD.

Sin embargo, debe tenerse en cuenta que el método tradicional de inicio en caliente de anticuerpos solo bloquea la actividad de la polimerasa 5'→3' de la ADN polimerasa Taq, lo que solo puede prevenir la amplificación no específica causada por un desajuste o un dímero de cebador a bajas temperaturas.Sin embargo, como se mencionó anteriormente, la ADN polimerasa Taq no solo tiene actividad polimerasa 5'→3' sino también actividad exonucleasa 5'→3'. Esta actividad exonucleasa puede provocar la degradación de sondas no coincidentes u otros materiales a bajas temperaturas, lo que da lugar a algunas señales no específicas.

3. El anticuerpo Taq de doble bloqueo puede mejorar al doble la especificidad y la estabilidad de la amplificación

Como líder innovador en la industria nacional de enzimas moleculares, Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. (en adelante, Yeasen) se centra en la I+D y la producción de materias primas de enzimas moleculares y se atreve a innovar. Apoyándose en su propia plataforma madura de detección de anticuerpos, examina el anticuerpo de bloqueo con la ADN polimerasa Taq como molécula objetivo. Después de años de minuciosa investigación y optimización del sistema, ha desarrollado El anticuerpo anti-Taq ADN polimerasa de doble bloqueNo solo puede bloquear la actividad de la polimerasa de la ADN polimerasa Taq, sino que también bloquea la actividad de la exonucleasa de la ADN polimerasa Taq. En un enfoque doble, no solo puede prevenir eficazmente la amplificación no específica causada por un desajuste o un dímero de cebador, sino que también evita que la degradación del material genere señales no específicas y mejora al doble la estabilidad del reactivo.

4. Presentación del rendimiento del Taq de doble bloque de Yeasen anticuerpo

4.1 El uso del anticuerpo Taq de doble bloqueo es preciso y más sensible

Después de bloquear la polimerasa Taq con el anticuerpo de doble bloqueo de Yeasen y el anticuerpo de la compañía T, las muestras positivas fueron detectadas por ARMS-PCR.

Figura 1. Curva de amplificación ARMS-PCR; Azul: anticuerpo bloqueador de la compañía T; Rojo: Anticuerpo de doble bloqueo de Yeasen

Se puede observar en la Figura 1 que la polimerasa Taq bloqueada por el anticuerpo de doble bloqueo de Yeasen tiene una tipificación precisa y una mayor sensibilidad en la amplificación ARMS-PCR.

4.2 El anticuerpo Taq de doble bloqueo actúa eficazmente Bloqueó la actividad exonucleasa de la ADN polimerasa Taq

Las sondas de cebadores sintetizadas se combinaron con la solución de reacción de la ADN polimerasa Taq bloqueada por anticuerpos no cerrados y doblemente bloqueados respectivamente y reaccionaron a 40 ℃ para detectar sus señales de fluorescencia.

Figura 2. Detección de la eficiencia de bloqueo del anticuerpo de doble bloqueo para la actividad exonucleasa; Amarillo: grupo de ADN polimerasa Taq no cerrado; Púrpura: grupo de ADN polimerasa Taq bloqueado por anticuerpo de doble bloqueo

Se puede ver en la Figura 2 que el anticuerpo de doble bloqueo puede bloquear eficazmente la actividad exonucleasa de la ADN polimerasa Taq.

4.3 El anticuerpo Taq de doble bloqueo puede mejorar eficazmente la estabilidad del reactivo de detección

La ADN polimerasa Taq se bloqueó con un anticuerpo de bloqueo tradicional y un anticuerpo de doble bloqueo respectivamente y se configuró en una premezcla completa que contenía una sonda de cebador. Se amplificaron 10 000 copias del plásmido ASF a 4 ℃ durante 10 días o a 37 ℃ durante 1, 3 y 5 días. Se observaron los cambios en la curva de amplificación y el valor Ct, y se compararon los efectos del anticuerpo de bloqueo tradicional y el anticuerpo de doble bloqueo sobre la estabilidad de la solución de reacción de premezcla completa.

Figura 3.Curva de amplificación de 10000 copias del plásmido ASF amplificado mediante la solución de reacción de bloqueo del anticuerpo de bloqueo tradicional (a) y del anticuerpo de doble bloqueo (b); Azul: conservar a 4℃ durante 10 días; Rojo: colocado a 4℃ durante 0 días (control)

En la Figura 3 se puede observar que el anticuerpo de doble bloqueo puede mantener la estabilidad de la solución de reacción y mejorar eficazmente la estabilidad del reactivo de detección en comparación con el anticuerpo de bloqueo tradicional. La curva de amplificación y el valor Ct no cambiaron significativamente después de que toda la premezcla que contenía la sonda cebadora se bloqueara con un anticuerpo de doble bloqueo y se colocara a 4 ℃ durante 10 días.

Figura 4. Curva de amplificación de 10000 copias del plásmido ASF amplificado mediante la solución de reacción de bloqueo del anticuerpo de bloqueo tradicional (a) y del anticuerpo de doble bloqueo (b); Azul: conservar a 37℃ durante 5 días; Verde: 37℃ durante 3 días; Amarillo: 37℃ durante 1 día; Rojo: colocado a 37℃ durante 0 días (control)

En la Figura 4 se puede observar que el anticuerpo de doble bloqueo puede mantener la estabilidad de la solución de reacción y mejorar eficazmente la estabilidad del reactivo de detección en comparación con el anticuerpo de bloqueo tradicional. El anticuerpo de doble bloqueo bloquea toda la premezcla que contiene el cebador-sonda, y la diferencia del valor Ct es inferior a 0,2 después de colocarse a 37 ℃ durante 1, 3 y 5 días.

4.4 Los anticuerpos Taq de doble bloqueo ayudan a resolver el problema de la desviación de la línea base

Cuando algunos cebadores cooperan con un tampón y unos instrumentos específicos, se producirá una desviación de la línea base. Yeasen probó muchos métodos para mejorar el problema de la línea base y descubrió que el anticuerpo de doble bloque era más propicio para una línea base estable.

Figura 5. Curva de amplificación del gen N (a) y del gen ACT (b); Rojo: anticuerpo bloqueador tradicional; Verde: anticuerpo de doble bloqueo

Como se puede ver en la Figura 5, el uso de anticuerpos de doble bloque bajo cebadores y tampones específicos puede ayudar a resolver el problema de la deriva de la línea base.

4.5 Se obtuvo una buena linealidad utilizando el anticuerpo Taq de doble bloque

Se amplificaron 100000, 10000, 1000 y 100 copias de plásmidos dobles ASF/ACT con la solución de reacción bloqueada por un anticuerpo de doble bloqueo y se realizó la curva estándar.

Figura 6. Curvas estándar del gen ASF (a) y del gen ACT (b) producidas por la solución de reacción de doble bloque

Como se puede ver en la Figura 6, la curva estándar R2 del gen ASF es 0,998 y la eficiencia de amplificación es 98,848%; La curva estándar R2 del gen ACT fue de 0,998 y la eficiencia de amplificación fue del 98,113%.

4.6 Taq de doble bloque El anticuerpo puede liberar rápidamente la actividad enzimática

La polimerasa Taq se bloqueó con el anticuerpo de la compañía T importada y Anticuerpo de doble bloqueo de Yeasen (cat. n.° 31303) respectivamente, y la actividad enzimática se detectó después del choque térmico a 95 ℃ durante 20 s. Se puede ver que 31303 puede liberar más del 95% de la actividad enzimática después del choque térmico a 95 ℃ durante 20 s, lo que es equivalente al anticuerpo de la compañía T.

Tabla 1. Actividad enzimática

4.7 Taq de doble bloque Anticuerpo Puede bloquear muchos tipos de enzimas Taq

Se bloquearon tres tipos de enzimas Taq (tipo salvaje y 2 mutantes) con el anticuerpo de doble bloqueo de Yeasen (cat. n.° 31303), y la relación de bloqueo fue de 1 μg: 5 U, midiendo el valor de fluorescencia y la eficiencia de sellado. Se puede observar que el efecto de bloqueo del anticuerpo de doble bloqueo de Yeasen (cat. n.° 31303) es mejor para diferentes tipos de enzimas Taq.

Tabla 2. Eficiencia de bloqueo de diferentes tipos de enzimas Taq

4.8 De Yeasen El anticuerpo Taq de doble bloqueo no dejó residuos genómicos en ratones

Tomando agua como plantilla para el control negativo y genoma de ratón como plantilla para el control positivo, se amplificaron 31303 lotes diferentes. Se encontró que el fragmento objetivo no se amplificó en la muestra, lo que indica que no había residuos de genoma de ratón en el anticuerpo.

Figura 7. Diagrama de detección de residuos del genoma del ratón

Nota: - es el control negativo, + es un control positivo y 1-5 son 31303 muestras de diferentes lotes.

5. Información del producto