Este artículo describe la aplicación de Concanavalina A y su acoplamiento covalente con perlas magnéticas.
Parte 1. Concanavalina A
Las perlas magnéticas recubiertas de concanavalina A (perlas ConA), como sugiere su nombre, son perlas biomagnéticas en las que la lectina vegetal concanavalina A (ConA) está acoplada a nanomateriales superparamagnéticos. A continuación, se presenta una breve introducción a las perlas magnéticas ConA.
La concanavalina A (ConA), una proteína lectina vegetal sin especificidad de grupo sanguíneo, fue la primera proteína lectina vegetal en ser aislada, purificada y cristalizada a partir de la sepia (Canavalia ensiformis, Pennisetum maritimum) desde 1936.
ConA tiene 2 formas principales dependiendo del pH de la solución en la que está presente: el homodímero α-2 o el homotetrámero α-4 [2]En condiciones alcalinas (pH > 7,0) existe como un tetrámero (que consta de cuatro subunidades de peso molecular de 26 kDa); en condiciones ácidas (pH 4,5-5,5), la Con A se disocia en una estructura dimérica activada (52 kDa). Además, la función de la ConA se ve afectada por cationes divalentes, por ejemplo, en ausencia de iones metálicos (Ca2+ y Mn2+), su conformación y función de unión a la glicoproteína no se pueden realizar.[1].
Fig. (1). Modelado molecular de (A) monómero de ConA, (B) dímero de ConA, (C) tetrámero de ConA con manosa, glucosa e iones metálicos.
Parte 2. Perlas
Las perlas biomagnéticas son una clase de microesferas magnéticas con tamaño de partícula nanométrico, formadas por polímeros y nanopartículas magnéticas inorgánicas. Las perlas magnéticas se pueden clasificar en tres categorías principales según su estructura: estructura de tipo núcleo-capa, estructura de tipo sándwich y estructura de tipo difuso. Los materiales magnéticos incluyen polvo de hierro puro, hierro carbonílico, mineral magnético, ortoferrita y aleación de hierro y cobalto. y otros.
Los nanomateriales magnéticos, debido a sus efectos especiales, como el efecto de tamaño pequeño, el efecto de superficie y el efecto de tamaño cuántico, etc., en el tamaño de Fe3Oh4 Las nanopartículas son de menos de 30 nm, la interferencia de la perturbación térmica dentro de las nanopartículas es significativa y, en este momento, estas nanopartículas muestran una propiedad magnética especial, es decir, superparamagnetismo. Fe superparamagnético3Oh4 Las nanopartículas se utilizan ampliamente en la industria biológica debido a sus propiedades de alta calidad, como no toxicidad, buena biocompatibilidad, propiedades únicas de orientación magnética y facilidad de generación de calor en campos magnéticos alternos.
Por el contrario, el acoplamiento covalente de ConA con microesferas para la inmovilización de biomoléculas tiene las siguientes ventajas:
- Alta estabilidad de la unión del acoplamiento covalente para la reproducibilidad;
- Unión del ligando ConA a la superficie de microperlas para interacciones con moléculas diana;
- Caracterización cinética del entorno de la solución, adecuada para la manipulación experimental biológica;
Parte 3. Aplicación de perlas magnéticas ConA
Como se informa en la literatura, las principales aplicaciones de las perlas magnéticas de ConA se clasifican en tres escenarios: la separación de la membrana citoplasmática, el enriquecimiento de glicoproteínas y la separación de aspectos celulares inmovilizados.
Aplicación I: Separación por membrana citoplasmática
Utilizando perlas magnéticas de ConA afectadas por la activación de cationes divalentes, de modo que exista en Ca2+ y Mg2+ Los entornos de solución, que poseen la función de interacción de afinidad de α-D-manosilo terminal y α-D-glucosilo, utilizados en la purificación de la membrana plasmática, son una forma simple y eficiente. Por ejemplo, la separación de la membrana plasmática de células o tejidos es un paso clave para obtener más proteínas de membrana plasmática. La ConA es capaz de unirse a las proteínas glicosiladas en las células, y este principio se puede utilizar para obtener una membrana plasmática de mayor pureza. Los principales pasos de la operación son: inmovilización de ConA en perlas magnéticas mediante la unión de ConA biotinilada a perlas magnéticas de estreptavidina; incubación de membranas celulares con perlas magnéticas de ConA durante 1 h; adsorción en un bastidor magnético; lavado con TBS 5 veces; y elución de la solución de membrana citoplasmática con eluyente.[3].
Fig. 2. Pasos de purificación de perlas magnéticas ConA para membrana plasmática
Aplicación II: Enriquecimiento de glicoproteínas
La ConA es específica para la manosa y la glucosa y reconoce la manosa α-conjugada, que resulta ser el “oligosacárido central” de muchas glucoproteínas séricas y de membrana celular. Por lo tanto, se puede utilizar en inmunología para separar moléculas glucosiladas como las glucoproteínas en lisados de células o tejidos o en suero.
Un procedimiento importante fue que mediante nanoperlas magnéticas aminosilanizadas (MNP) reticuladas con ConA a través de un enlazador bifuncional, linoleato de bis-N-hidroxisuccinimida (DSS), para obtener perlas magnéticas de ConA; terminar la unión no específica de las nanoperlas magnéticas utilizando metoxietilenglicol (MEG), y llevar a cabo la separación magnética; añadir el extracto de las proteínas de membrana celular digeridas con tripsina para incubar tanto las perlas magnéticas de ConA como los glicopéptidos capturados, y finalmente eluir los glicopéptidos capturados, y llevar a cabo el secado al vacío. Las perlas magnéticas de ConA se incubaron, las perlas magnéticas de ConA que tenían glicoproteínas unidas se recogieron mediante el bastidor magnético, los no glicopéptidos se lavaron y, finalmente, los glicopéptidos capturados se eluyeron y secaron al vacío. Este método permite un análisis en profundidad de los sitios de glicosilación específicos de las proteínas asociadas a tumores (p. ej., EGFR).[4].
Fig. 3. Nanopartículas superparamagnéticas acopladas a diferentes lectinas.
Aplicación III: Aislamiento de células inmovilizadas
El uso de perlas magnéticas ConA (perlas magnéticas unidas covalentemente a la concanavalina A de alta pureza) para unirse a las glicoproteínas en las membranas celulares o nucleares, capturando así células o núcleos, permite la visualización de la manipulación experimental de pequeñas cantidades de células. Por ejemplo, las perlas magnéticas ConA se utilizan en CUT&Tag y CUT&RUN [5] experimentos, que son técnicas novedosas utilizadas para estudiar la estructura y función de la cromatina, y se inmovilizan mediante la unión de perlas magnéticas de ConA a las células para visualizar el funcionamiento y evitar el problema de pérdida de células causada por la centrifugación.
En comparación con la tecnología tradicional ChIP-seq para estudiar las interacciones ADN-proteína, CUT&Tag y CUT&RUN tienen las siguientes ventajas:
- Las perlas magnéticas de ConA se unen a las glicoproteínas de la membrana celular para visualizar la operación y mejorar la experiencia de la operación experimental;
- No es necesario centrifugar, solo perlas magnéticas de ConA adsorbidas en el soporte magnético para completar la separación de muestras de células y soluciones;
- Se puede operar con tan solo 10 células, lo que evita la necesidad de una gran cantidad de muestras para ChIP-seq.
Fig. 4. Diagrama esquemático del flujo del experimento ChIP-seq, CUT&Tag, CUT RUN
Parte 4. Perlas magnéticas recubiertas de concanavalina A de YEASEN
Las perlas magnéticas ConA, desarrolladas por YEASEN, son capaces de unirse a glicoproteínas, glicolípidos, polisacáridos y otras moléculas con modificación de la glicosilación de una manera rápida, eficiente, sensible y específica después de una estricta selección de la materia prima y una optimización y mejora de múltiples procesos. Se utiliza principalmente para el aislamiento de células o para el aislamiento de moléculas glicosiladas como las glicoproteínas en lisados de células o tejidos o suero, y se utiliza especialmente de forma directa para experimentos como CUT &RUN y CUT&Tag (una tecnología innovadora para experimentos ChIP-seq).
1.Características del producto
- Producción de lotes estable y mejor reproducibilidad de los resultados;
- Almacenamiento de rendimiento estable
- Eficiencia de captura de células >90%
2. Información del producto
| Gato N° | Gato n.° 19810ES |
| Tamaño | 1 ml/5 ml/20 ml |
| Color | Amarillo parduzco |
| Concentración de perlas | 10 mg/ml |
| Contenido sólido | 9-11 mg/ml |
| Tamaño de la cuenta | 1 micra |
| Capacidad | 105 células/µL de perlas |
3. Datos de rendimiento del producto
(1)Monodispersidad
En las mismas condiciones de tratamiento y con un aumento de 10×/40×, las perlas de ConA estaban básicamente monodispersas y no se observó ninguna aglomeración obvia en relación con el competidor.
| Perlas de materia prima YEASEN | Perlas de la competencia ConA | Cuentas YEASEN ConA (n.° de cat. 19810) |
Figura 5. Gráfico de resultados de monodispersidad
(2)Efecto de la unión de las perlas de ConA a las células
Se incubó la misma cantidad de células con las perlas durante la misma cantidad de tiempo, y la cantidad de células restantes después de la conjugación de las perlas ConA se detectó automáticamente en el analizador de células, y los resultados mostraron que YEASEN Las perlas ConA (Cat. n.° 19810) superaron a los productos de la competencia.
| Suspensión celular | Células restantes después de la unión de las perlas magnéticas ConA competitivas | Células restantes después de la unión de YEASEN Perlas magnéticas ConA |
Figura 6.Imagen de células unidas con perlas magnéticas ConA
(3) Número de unión celular y repetibilidad
Ambos YEASEN de 10µL Las perlas ConA (n.° de cat. 19810) y las perlas ConA de 10 µL de la competencia se unen a cantidades de células de nivel E7 comparables a las de la competencia. La captura de células fue >90 % en operaciones repetidas.
Figura 7. Los resultados de las perlas de ConA que se unen al número de células y la tasa de captura
(4) Estabilidad de aceleración
Dispensar a 1 mL/tubo. Las condiciones de almacenamiento fueron: tratamiento acelerado a 4℃, 37℃ durante 2, 4, 7, 11 y 14 días, y tratamiento de destrucción a -20℃ durante 1, 3, 6 y 8 días. Los resultados mostraron que bajo las mismas condiciones experimentales: la tasa de captura celular de los productos almacenados a 4℃, tratamiento acelerado a 37℃ y tratamiento de destrucción a -20℃ fue >95%, y el valor de CV de los tres grupos de réplicas bajo cada condición de tratamiento estuvo dentro del 1%, lo que mostró una buena reproducibilidad.
Fig. 8. Los resultados Tasa de captura de células y sesgo de repetibilidad de perlas de ConA bajo diferentes temperaturas y tiempos
Información de pedidos
| 19810ES |