در سال‌های اخیر، با توسعه سریع زیست‌پزشکی، ظهور درمان‌های سلولی و ژنی تحت همه‌گیری COVID-19، و ظهور واکسن‌های mRNA، اطمینان از ایمنی و قابلیت اطمینان محصولات بیولوژیکی به نقطه کانونی دولت‌ها و نهادهای نظارتی در سراسر جهان تبدیل شده است. آلودگی مایکوپلاسما یک نوع آلودگی رایج اما معمولاً چالش برانگیز برای از بین بردن است. الزامات مقرراتی "اطمینان از عدم آلودگی مایکوپلاسما" را برای فرآیندهای زیستی شامل کشت سلول الزامی می کند.
الزامات سازمان های نظارتی برای آزمایش مایکوپلاسما:
- «راهنمای FDA برای صنعت: خصوصیات و صلاحیت بسترهای سلولی و سایر مواد بیولوژیکی مورد استفاده در تولید واکسن‌های ویروسی برای نشانه‌های بیماری‌های عفونی» کنترل مایکوپلاسما را برای مواد خام، دانه‌های ویروسی و مایعات برداشت فرآوری نشده تصریح می‌کند.
- نسخه 2020 بخش سوم فارماکوپه چینی "آماده سازی و کنترل کیفیت بسترهای سلولی حیوانی مورد استفاده برای آزمایش تولید محصولات بیولوژیکی" به آزمایش مایکوپلاسما برای سلول های تولیدی، از جمله بانک های سلولی اصلی (MCB)، بانک های سلولی کار (WCB) و سلول های پایان تولید (EOPC) نیاز دارد.
- "راهنماهای فنی برای تحقیقات دارویی و ارزیابی محصولات سلول درمانی ایمنی (آزمایشی)" انجام آزمایش ایمنی مربوط به مایکوپلاسما را بر روی نمونه های میانی مناسب در مقاطع زمانی کلیدی یا اجرای اقدامات مربوطه برای کنترل توصیه می کند. آزمایش مایکوپلاسما نیز به عنوان آزمایش رهاسازی برای محصولات نهایی مورد نیاز است.
آزمایش اسید نوکلئیک (NAT) و روش های سنتی:
قبل از ظهور روش‌های تشخیص سریع مانند فناوری تقویت اسید نوکلئیک (NAT)، روش‌های کشت سنتی و سنجش سلول‌های شاخص استفاده می‌شد. با این حال، به دلیل چرخه‌های تشخیص طولانی یا مسائل حساسیت، این روش‌ها اغلب چرخه‌های تولید یا انتشار را طولانی‌تر می‌کنند یا بر اساس ارزیابی ریسک یا اکتشاف روش‌های جایگزین، آزادسازی مشروط مواد سلولی را ضروری می‌کنند. با پیشرفت درمان‌های سلولی و ژنی، تقاضای فزاینده‌ای در صنعت برای روش‌های تشخیص مایکوپلاسما با به موقع و حساسیت بالاتر وجود دارد. ماندگاری کوتاه محصولات نمی تواند دوره های آزمایش طولانی را حفظ کند، بنابراین روش های NAT به عنوان جایگزین های مطلوب ظاهر شده اند.
در حال حاضر، فارماکوپه اروپا (EP) <2.6.7>، فارماکوپه ژاپنی (JP)، و فارماکوپه ایالات متحده (USP) <63> همه روش های NAT را به عنوان روش های تشخیص مایکوپلاسما در نظر گرفته اند. اما اعتبار سنجی این روش و مقایسه با روش های سنتی برای اطمینان از اینکه حساسیت آن کمتر نیست، پیش نیاز استفاده از آن است. اگرچه نسخه 2020 فارماکوپه چینی (ChP) NAT را به عنوان یک روش تشخیص مایکوپلاسما درج نکرده است، اما امکان استفاده از "روش های دیگر به رسمیت شناخته شده توسط مرجع ملی نظارت بر دارو" را ذکر کرده است. در ماه مه 2022، مرکز بررسی داروی اداره ملی محصولات پزشکی (NMPA) "راهنمای فنی برای تحقیقات دارویی و ارزیابی محصولات سلول درمانی ایمنی (آزمایشی)" را منتشر کرد که پیشنهاد می‌کند توسعه روش‌های جدید استریل و تشخیص مایکوپلاسما را برای آزمایش رهاسازی تحت شرایط خاص و در شرایطی که حجم نمونه داروسازی محدود است و به روش‌های رهاسازی فارماکوپید فارماکوپید محدود است، ارائه کرد. بنابراین، انتظار می‌رود که روش‌های NAT به‌طور فزاینده‌ای توسط تامین‌کنندگان مواد خام بیشتر و شرکت‌های محصولات دارویی درمان پیشرفته (ATMP) به‌عنوان روشی که قادر به پشتیبانی از آزمایش آزادسازی سریع مایکوپلاسما باشد، استفاده شود.
روش NAT - الزامات اعتبارسنجی روش
فرآیند اعتبار سنجی برای روش های NAT به طور مفصل در فارماکوپه اروپایی <2.6 توضیح داده شده است.7> و فارماکوپه ژاپنی، که محتوای آنها اساساً سازگار است. مؤسسه ملی کنترل غذا و دارو (NIFDC) نیز مقاله‌ای با عنوان «ملاحظات روش‌های تشخیص اسید نوکلئیک و اعتبارسنجی روش‌شناختی برای آزمایش مایکوپلاسما» منتشر کرده است که هدف آن ارائه راهنمایی برای توسعه‌دهندگان و کاربران روش‌های تقویت اسید نوکلئیک مایکوپلاسما در چین است. ویژگی، حد تشخیص و استحکام برای تایید روش‌های NAT مایکوپلاسما ضروری است. اگر از کیت های تجاری برای تشخیص مایکوپلاسما استفاده شود، اعتبارسنجی مناسب بودن روش را می توان بر اساس گزارش عملکرد کیت جامع تامین کننده، همراه با محیط آزمایشگاهی و نوع نمونه انجام داد.
ویژگی:
Specificity به توانایی یک روش تحلیلی برای تعیین دقیق آنالیت در حضور سایر اجزا (مانند ناخالصی ها، محصولات تجزیه، مواد کمکی و غیره) اشاره دارد. EP بر نیاز به تمرکز بر واکنش‌های متقابل بین سایر گونه‌های باکتریایی که نزدیک به درخت فیلوژنتیک هستند، مانند کلستریدیوم، لاکتوباسیلوس و استرپتوکوک در باکتری‌های گرم مثبت تأکید می‌کند. همچنین باید به انواع آلاینده های رایج مانند آلودگی DNA انسان در سلول های میزبان و محیط های آزمایشی توجه شود.
حد تشخیص:
حد تشخیص کمترین مقدار آنالیت قابل تشخیص در یک نمونه است. این به عنوان یک مبنای شناسایی کیفی عمل می کند و نیازی به تعیین کمیت به عنوان یک مقدار دقیق ندارد. EP به 24 نقطه داده تشخیص برای هر گونه مایکوپلاسما در هر غلظت رقت نیاز دارد. این را می توان با انجام سه رقت سریال 10 برابری مستقل در روزهای مختلف، با هشت تشخیص مکرر برای هر گرادیان رقت، یا با انجام چهار رقت سریال 10 برابری مستقل در روزهای مختلف، با شش تشخیص تکراری برای هر گرادیان رقت، به دست آورد. نرخ تشخیص مثبت بیش از 95٪ را می توان به عنوان حد تشخیص در نظر گرفت. برای انواع مایکوپلاسما که نیاز به تایید حد تشخیص دارند، سازندگان کیت باید تا آنجا که ممکن است انواع مایکوپلاسما را پوشش دهند که طبق فارماکوپه های نظارتی لازم است و محدودیت های تشخیص برای هر نوع مایکوپلاسما را بررسی کنند. برای شرکت های بیودارویی، توصیه می شود که انواع مایکوپلاسمای انسانی را نیز در نظر بگیرند.
- اگر سلول‌ها یا مواد پرندگان در طول فرآیند تولید مورد استفاده قرار گیرند یا با آنها مواجه شویم، تأیید حد تشخیص برای Mycoplasma synoviae باید انجام شود.
- اگر در طول فرآیند تولید از حشره یا مواد گیاهی استفاده شود یا با آن مواجه شد، تأیید حد تشخیص برای آکوله پلاسما باید انجام شود.
- مایکوپلاسمای بینی خوک در نمونه های آلوده به مایکوپلاسما بسیار شایع است و توجه موسسه کنترل غذا و داروی چین را به خود جلب کرده است.
در مقایسه با فارماکوپه اروپایی، فارماکوپه ژاپنی به مایکوپلاسمای پرندگان اشاره نمی کند که برای آن تأیید حد تشخیص لازم است، اما مایکوپلاسمای بزاقی را شامل می شود.
استحکام:
استحکام به توانایی یک روش برای مقاومت در برابر تغییرات کوچک در شرایط اندازه‌گیری بدون تأثیرگذاری اشاره دارد، که مبنایی را برای استفاده از روش تعیین‌شده در آزمایش‌های معمول فراهم می‌کند. ارزیابی استحکام باید بر روی تحمل روش‌های تشخیص مایکوپلاسما به تغییرات غلظت MgCl2، آغازگرها و dNTPs در معرف‌های تشخیص، تغییرات در کیت‌های استخراج اسید نوکلئیک یا مراحل استخراج، و استفاده از تقویت‌کننده‌های مختلف اسید نوکلئیک متمرکز شود.
مطالعه مقایسه پذیری
اگر قرار است NAT به عنوان جایگزینی برای روش های دارویی استفاده شود، لازم است از طریق مقایسه تایید شود که NAT می تواند جایگزین روش های مبتنی بر کشت یا روش های کشت سلولی شاخص شود.این معمولاً شامل در نظر گرفتن حد تشخیص روش و همچنین ویژگی (مانند محدوده پوشش مایکوپلاسما و موارد مثبت کاذب احتمالی) است. برای مقایسه محدودیت‌های تشخیص، باید معیارهایی را داشته باشد که "محدودیت تشخیص 10 CFU/mL می‌تواند جایگزین روش‌های مبتنی بر کشت شود، و حد تشخیص 100 CFU/mL می‌تواند جایگزین روش‌های کشت سلولی شاخص شود."
دو رویکرد اختیاری برای انجام مطالعات مقایسه وجود دارد:
- انجام آزمایش‌های همزمان با استفاده از سویه‌های مایکوپلاسما تأیید شده برای هر دو روش NAT و فارمکوپیال برای تأیید حد تشخیص.
- مقایسه نتایج اعتبار NAT با نتایج اعتبارسنجی روش دارویی قبلی، اما مستندسازی دقیق فایل‌های تایید برای استانداردهای مایکوپلاسما مورد استفاده در هر دو روش مورد نیاز است.
NAT Mycoplasma qPCR Detection - راه حل جامع
محصولات مرتبط
کیت تست Yeasen Mycoplasma qPCR (روش پروب) یک محصول تشخیص سریع کیفی مبتنی بر NAT (تکنیک‌های تقویت اسید نوکلئیک) برای آلودگی بالقوه مایکوپلاسما در مواد خام، بانک‌های سلولی، دانه‌های ویروسی، مایعات برداشت ویروس یا سلول و سلول‌های درمانی است. این کیت، بر اساس فناوری کمی PCR، از پروب های فلورسانس Taqman برای شناسایی کیفی DNA مایکوپلاسما در نمونه آزمایشی استفاده می کند که بیش از 160 توالی DNA مایکوپلاسما را پوشش می دهد. این به شدت از دستورالعمل ها و الزامات EP 2.6.7 و JP G3 برای تشخیص مایکوپلاسما پیروی می کند و حساسیت بالا، ویژگی خوب و ایمنی را نشان می دهد. می توان آن را همراه با کیت پیش تصفیه نمونه DNA باقیمانده مغناطیسی MolPure® برای استخراج دستی نمونه ها یا استخراج خودکار اسیدهای نوکلئیک با استفاده از استخراج کننده اسید نوکلئیک کاملاً خودکار Auto-Pure 32A استفاده کرد. پس از پیش تیمار نمونه برای حذف ناخالصی های مزاحم و به دست آوردن DNA مایکوپلاسما خالص، سیگنال فلورسانس پروب از طریق qPCR جمع آوری می شود تا نتیجه تشخیص مشخص شود.
خدمات فنی
- ارائه گزارش‌های اعتبارسنجی جامع برای کیت تست Mycoplasma qPCR.
- ارائه خدمات فنی برای اعتبار سنجی کاربرد نمونه مشتری.
- ارائه پشتیبانی حسابرسی
| توضیحات | شماره قطعه |
| 18461ES | |
| کیت تشخیص مایکوپلاسما qPCR MycAway™ (2G) | 40619ES |