La désoxyribonucléase I (DNase I) est une endonucléase dont l'application ne se limite pas à maintenir l'intégrité de l'ARN, mais également à analyser l'empreinte de l'ADN, à générer des bibliothèques d'ADN aléatoires, à réduire l'adhérence des lysats cellulaires ou des extraits de protéines, etc. En un mot, la DNase I peut être utilisée dans presque toutes les applications qui nécessitent des clivages enzymatiques de l'ADN. Voici une introduction détaillée à la DNase I et à son application spécifique.

1. Qu'est-ce que la DNase I ?
2. DNase I pour la préparation de l'extraction d'ARN sans ADN
3. DNase I pour la transcription in vitro afin d'éliminer l'ADN matrice
4. DNase I pour l'élimination de l'ARNr
5. DNase I pour le marquage de l'ADN
6. Autres applications
7. Guide de sélection des produits DNase I

1. Qu'est-ce que la DNase I ?

Désoxyribonucléase I (DNase I) est une endonucléase non spécifique qui peut digérer l'ADN simple ou double brin, présent dans différents tissus et fluides corporels. Elle peut hydrolyser les liaisons phosphodiester pour produire des mono- et oligodésoxynucléotides contenant un groupe 5'-phosphate et un groupe 3'-OH. La plage de pH de travail optimale de la DNase I est de 7-8, son activité dépend du Ca2+ et peut être activée par des ions métalliques divalents tels que Mn2+, Mg2+, Zn2+, etc. En présence de Mg2+, la DNase I cisaille de manière aléatoire n'importe quel site d'ADN double brin ; en présence de Mn2+, la DNase I peut cisailler l'ADN double brin au même site pour former une extrémité franche ou des extrémités collantes de 1 à 2 nucléotides.

Figure 1. Schéma du clivage de l'ADNdb par la DNase I en présence de Mg2+ et Mn2+.

Bien que les clivages de la DNase I soient généralement considérés comme des clivages non spécifiques, la DNase I est plus susceptible d'agir sur certains fragments de séquence, tels que la région du petit sillon, et est plus susceptible de cliver les séquences purine-pyrimidine. Cependant, lorsque la DNase I agit sur un ADNds hétérogène, les quatre bases seront clivées et l'effet sur une base spécifique ne sera pas plus de 3 fois supérieur à celui des autres bases.

2. DNase I pour la préparation de l'extraction d'ARN sans ADN

Dans les expériences biologiques, la première étape consiste à préparer l'acide nucléique pour étudier les différentes fonctions de l'ARN. Cependant, comme l'ADN et l'ARN sont souvent libérés ensemble au cours du processus de lyse cellulaire, l'interférence entre les deux ne peut être évitée, quelle que soit la solution d'extraction utilisée. Il faut donc utiliser des enzymes spécifiques pour éliminer l'interférence. Pour une extraction d'ARN de haute qualité, la DNase I est utilisée pour éliminer l'ADN résiduel de l'échantillon.

La DNase I peut dégrader l'ADN double brin et simple brin en oligonucléotides et nucléotides simples, et l'ADN dans le produit de préparation d'ARN peut être efficacement dégradé. La DNase I est ensuite inactivée par chauffage avec un tampon d'arrêt. Pendant le processus de chauffage, la structure en épingle à cheveux de la molécule d'ARN peut être ouverte, ce qui facilite l'entrée directe de l'ARN dans le processus de transcription inverse.
La qualité de l'ARN aura une incidence directe sur les données expérimentales dans une large mesure. En général, les résidus d'ADNg ne peuvent pas être complètement évités lors de l'extraction de l'ARN. Par conséquent, il est généralement recommandé de traiter les échantillons d'ARN avec de la DNase I pour digérer l'ADNg résiduel avant de procéder à des applications en aval (par exemple, analyse de l'expression de l'ARNm, analyse du transcriptome, etc.). L'étape de digestion de l'ADNg peut être réalisée pendant l'extraction de l'ARN, après l'extraction de l'ARN ou avant la transcription inverse de l'ARN.Selon le positionnement du produit, les produits fournis par Yeasen sont les suivants :

Tableau 1 : Liste des produits liés à l'élimination de l'ADN, à l'extraction de l'ARN ou avant la transcription inverse

3. DNase I pour la transcription in vitro afin d'éliminer l'ADN matrice

La transcription in vitro (IVT) utilise principalement l'ADN comme modèle, ainsi que les substrats et tampons correspondants pour obtenir l'ARN par transcription in vitro. Dans les expériences de transcription in vitro, les ARN polymérases telles que T7, T3 et SP6 sont couramment utilisées pour la synthèse de l'ARN. L'ARN synthétisé peut contenir des résidus d'ADN. L'élimination des résidus d'ADN est bénéfique pour le développement des expériences en aval. Par exemple, au stade du développement du vaccin à ARNm, l'élimination des résidus est une étape critique, qui peut réduire la difficulté de la purification en aval et augmenter la pureté du produit. Le modèle d'ADN est généralement éliminé à l'aide de la DNase I recombinante (sans RNase).Selon le processus de synthèse de l'ARNm, les produits fournis par Yeasen sont les suivants :