Quelles enzymes les scientifiques utilisent-ils pour lier un nouveau gène ? Il va sans dire que l'ADN ligase en fait partie. Pourquoi l'ADN ligase est-elle si importante dans l'ADN recombinant ? Parce que l'ADN ligase est responsable de la ligature du fragment cible au vecteur, ce qui est l'un des éléments clés qui déterminent le succès de l'expérience. En tant que type d'ADN ligase, quel rôle joue l'ADN ligase T4 dans les expériences de clonage moléculaire ? Comment fonctionne-t-elle ? L'ADN ligase T4 sera présentée en détail ci-après.

1. Qu'est-ce que la T4 ADN ligase ?
2. Quelle est la fonction de l'ADN ligase T4 ?
3. L'ADN ligase T4 de Yeasen Biotech peut être utilisée pour la ligature de l'adaptateur NGS
4. Guide de sélection pour la ligase ADN T4 de Yeasen Biotech

1. Qu'est-ce que la T4 ADN ligase ?

L'ADN ligase T4 est une ligase dépendante de l'ATP qui catalyse la réaction de ligature entre les molécules d'ADN. Elle forme principalement du phosphodiester en liant les extrémités 3'-hydroxyle et 5'-phosphate. Les ADN ligases sont impliquées dans les processus de réplication et de réparation de l'ADN dans tous les organismes. L'ADN ligase T4 codée par le phage est produite lors de l'infection d'E. coli par le phage T4.
Les ligases utilisées en génie génétique sont principalement l'ADN ligase d'E. coli et l'ADN ligase T4, cette dernière étant actuellement la plus largement utilisée. L'ADN ligase T4 peut réparer les entailles monocaténaires sur l'ADN double brin, l'ARN double brin ou les brins hybrides ADN/ARN pour connecter deux nucléotides adjacents, et joue un rôle important dans la réparation et la recombinaison de l'ADN.
Dans le processus de construction de plasmides recombinants, l'ADN ligase T4 peut être utilisée conjointement avec des enzymes de restriction pour terminer l'expérience de construction de plasmides recombinants. Elle peut catalyser la formation d'une liaison phosphodiester entre l'extrémité 5'-P et l'extrémité 3'-OH de l'ADN double brin et présente une bonne efficacité de connexion pour la connexion d'extrémités collantes et la connexion d'extrémités franches.

Figure 1. Mécanisme de la ligase ADN T4

2. Quelle est la fonction de l'ADN ligase T4 ?

2.1 Construction vectorielle

Dans les expériences de construction de vecteurs, différentes enzymes de restriction peuvent produire différents types d'extrémités. Pour différentes extrémités, l'ADN ligase T4 aura différentes stratégies de ligature.

2.1.1 Clonage avec des enzymes de restriction, extrémités collantes produites par digestion unique

Lors de la construction du vecteur, si la même endonucléase de restriction est utilisée pour couper le fragment d'ADN du gène cible et que la molécule du vecteur peut produire la même extrémité collante, l'ADN ligase T4 peut directement effectuer la connexion de recombinaison. Cependant, comme les extrémités collantes sont les mêmes, le gène cible peut être inséré dans le vecteur dans le sens direct ou inverse, ce qui augmentera facilement la charge de travail de sélection des clones recombinants corrects. Envisagez d'utiliser la méthode de digestion à double enzyme pour la construction du vecteur.
De plus, les extrémités cohésives du vecteur préparé par digestion enzymatique unique peuvent également être appariées, puis des liaisons phosphodiester se forment entre les nucléotides sous l'action de la ligase d'ADN T4, ce qui entraîne l'auto-ligature du vecteur. L'utilisation de la phosphatase alcaline pour traiter le vecteur digéré peut éliminer le groupe phosphate à l'extrémité 5' du vecteur de sorte que le vecteur ne peut pas achever l'auto-ligature. Ainsi, sous l'action de la ligase d'ADN T4, le vecteur et le fragment cible sont connectés pour achever la construction du vecteur recombinant.

2.1.2 Clonage avec des enzymes de restriction, extrémités collantes produites par double digestion

Lors de la construction du vecteur, si deux enzymes de restriction avec des extrémités collantes différentes sont utilisées pour digérer respectivement le fragment cible et le vecteur, deux extrémités collantes différentes peuvent être générées. À ce stade, l'ADN ligase T4 peut ligaturer sélectivement les mêmes extrémités collantes pour garantir que le fragment cible est inséré dans le vecteur dans la bonne direction. Lorsque le fragment cible et le vecteur de la figure 2 sont digérés avec EcoR I et BamH I en même temps, les mêmes extrémités collantes peuvent être connectées. Il n'y a qu'une seule direction de ligature entre le fragment cible et le vecteur.

Figure 2. Ligature des extrémités collantes générée par digestion à double enzyme^[1]

2.1.3 Clonage de fragments de restriction, extrémité franche

Certaines endonucléases de restriction peuvent également générer des extrémités franches lors des clivages enzymatiques, comme Sma I et d'autres. L'ADN ligase T4 peut former directement une liaison phosphodiester entre le vecteur et l'insert, et il n'est pas nécessaire d'apparier les bases. Cependant, cette méthode a une faible efficacité de ligature et est sujette à l'auto-ligature du vecteur. En général, les extrémités franches peuvent être converties en extrémités collantes puis ligaturées. Par exemple, l'ajout de bases poly A et poly T complémentaires aux extrémités du fragment cible et du vecteur et aux extrémités complémentaires artificiellement collantes améliore respectivement l'efficacité de la connexion par la désoxynucléotidyl transférase terminale.

2.1.4 Clonage TA

Le vecteur T utilisé dans le clonage TA présente un surplomb T à l'extrémité 3'. Lorsque la séquence d'ADN du fragment cible n'est pas claire, le fragment du gène cible peut être connecté au vecteur T par clonage TA, et le gène cible peut être déterminé par séquençage. L'ADN polymérase Taq utilisée dans la PCR a une activité de transférase terminale et peut ajouter un nucléotide « A » à l'extrémité 3' du fragment d'ADN. L'ADN ligase T4 peut connecter directement le produit amplifié par l'ADN polymérase Taq au vecteur T, et le produit amplifié par PCR peut atteindre l'objectif d'un clonage efficace sans ajouter d'adaptateurs artificiels.

Figure 3. Le flux de travail du clonage TA^[2]

2.2 Ligature de l'adaptateur NGS

Lors de la construction de la bibliothèque de séquençage de nouvelle génération, il est nécessaire de connecter l'adaptateur artificiel au produit PCR avant qu'il puisse être fixé sur la cellule d'écoulement de la puce de séquençage pour terminer le séquençage. La construction d'une bibliothèque de liaison de ligature de clonage TA est un moyen technique très courant, et son principe est similaire au clonage TA mentionné ci-dessus. Une fois que le fragment d'ADN à séquencer est phosphorylé à l'extrémité 5' et que « A » est ajouté à l'extrémité 3', il est complémentaire et apparié à l'adaptateur avec l'extrémité collante « T ». Le double brin complet est ensuite formé et séquencé par la machine.
Lors de la ligature TA, différents types d'échantillons ou la complexité de la structure du fragment d'acide nucléique affecteront l'efficacité de la ligature, de sorte que les adaptateurs de différentes plates-formes auront également un impact sur le résultat final de la bibliothèque.
Par exemple, l'adaptateur à bulles de la plate-forme MGI a une structure secondaire spéciale et nécessite une efficacité de ligature très élevée pour l'ADN ligase T4, et la réduction de l'efficacité de ligature affecte directement le rendement de la bibliothèque.

Figure 4. Processus général de ligature de l'adaptateur

3.La ligase ADN T4 de Yeasen Biotech peut être utilisée pour la ligature de l'adaptateur NGS

Yeasen Biotech a spécialement développé ADN ligase T4 rapide Pour la ligature de fragments d'ADN et d'adaptateurs dans le processus de construction de bibliothèques NGS. L'enzyme a une capacité de ligature efficace, non seulement une vitesse de connexion rapide mais également une compatibilité avec divers types d'échantillons, ce qui est plus avantageux pour la connexion de fragments d'acide nucléique avec des structures complexes. À l'heure actuelle, il a été vérifié par séquençage à haut débit d'un grand nombre de clients. Pour la connexion d'adaptateurs Bubble sur la plate-forme MGI, une excellente qualité de séquençage peut également être obtenue.

3.1 Yeasen Biotech Fast T4 DNA ligase avec une efficacité de ligature ultra-élevée

Utilisez la ligase d'ADN Fast T4 de Yeasen Biotech pour construire des bibliothèques avec différents types d'adaptateurs. L'échantillon est un mimétique d'ADNcf de 170 pb et la bibliothèque Agilent 2100 est utilisée pour détecter les résultats. ①Produit adaptateur non connecté ; ②Produit adaptateur à extrémité unique ; ③Produit adaptateur à double extrémité ; ④Adaptateur résiduel. D'après les résultats, on peut voir que l'efficacité de ligature des adaptateurs à extrémité unique et à double extrémité est très élevée.

Figure 5. Différents types de produits de ligature détectés par l'Agilent 2100

3.2 Yeasen Biotech Fast T4 DNA ligase avec un excellent rendement de bibliothèque

En utilisant la ligase ADN T4 rapide pour différents types de construction de bibliothèques, par rapport aux autres ligases ADN T4, les rendements des bibliothèques sont meilleurs.

Tableau 1. Les bibliothèques produisent différents types d'échantillons

4. Guide de sélection pour la ligase ADN T4 de Yeasen Biotech

Yeasen est une société de biotechnologie engagée dans la recherche, le développement, la production et la vente de trois réactifs biologiques majeurs : les molécules, les protéines et les cellules. En plus de la ligase ADN Fast T4, Yeasen Biotech possède également Nouvelle ADN ligase T4 et ADN ligase T4 rapide à choisir. Vous pouvez les choisir en fonction des applications affichées dans le tableau suivant :

Tableau 2 : Produits associés

Références

[1] W. Yuan. Ingénierie génétique[M]. Presses de l'industrie chimique, 2019.
[2] Clark DP, Pazdernik NJ, Mcgehee M R. Clonage de gènes pour la biologie synthétique - ScienceDirect[J]. Biologie moléculaire (troisième édition), 2019 : 199-239.
[3] Tomkinson AE, Vijayakumar S, Pascal JM, et al. Ligases d'ADN : structure, mécanisme de réaction et fonction[J]. Chemical Reviews, 2006, 106(2):687-699.
[4] Shuman S. DNA Ligases : progrès et perspectives[J]. Journal of Biological Chemistry, 2009, 284(26):17365-17369.