1. Comment empêcher la dégradation de l’ARN ?

2. Que sont les inhibiteurs de la RNase ?

3. Que fait l’inhibiteur de RNase ?

4. Quelles sont les caractéristiques d’un inhibiteur de RNase murin ?

5. Produits associés et performances

6. Produits connexes

7. Questions fréquemment posées

1. Comment empêcher la dégradation de l’ARN ?

La RNase joue un rôle important dans le métabolisme des acides nucléiques et peut être trouvée dans presque tous les types de procaryotes et d'eucaryotes. La RNase est sécrétée dans les fluides corporels tels que les larmes, la salive et la sueur pour se défendre contre l'invasion des micro-organismes, et la RNase est également présente dans les débris cutanés. Cependant, la principale source de RNase dans la plupart des environnements est constituée par les micro-organismes, à savoir les bactéries et les champignons. La RNase est extrêmement difficile à inactiver et présente une grande stabilité, une résistance à la chaleur, aux acides et aux alcalis. Après dénaturation thermique, elle peut rapidement retrouver sa structure d'origine. La RNase est généralement très active et est largement distribuée dans les cellules et tissus eucaryotes et procaryotes. L'ARN de l'échantillon peut se dégrader complètement avec juste une trace de contamination par la RNase. La contamination par la RNase dans les études peut provenir de sources internes et externes. La RNase dans les cellules est principalement une source endogène de contamination, tandis que les sources exogènes comprennent les fournitures expérimentales, l'environnement du laboratoire et les expérimentateurs eux-mêmes. Les ARNases, en particulier celles de la famille des ARNases A, sont de petites protéines compactes contenant quelques résidus de cystéine capables de former de nombreuses liaisons disulfures intramoléculaires. Après retour à température ambiante, en l'absence d'agent dénaturant, l'ARNase dénaturée retrouvera sa structure naturelle et certaines fonctions. Par conséquent, les ARNases conservent une activité considérable après des cycles répétés de congélation-décongélation, même après autoclavage. La nature stable de ces enzymes les rend résistantes à de nombreuses méthodes de décontamination, qui nécessitent généralement des méthodes chimiques agressives pour éliminer les ARNases des surfaces et des solutions.

Pour éviter la dégradation de l'ARN vulnérable, des précautions particulières doivent être prises lors de la manipulation de l'ARN. Pour contrôler la RNase exogène, l'opérateur doit porter des gants pendant l'expérience et changer de gants après avoir touché la peau, les poignées de porte et la surface d'objets ordinaires. Et l'opérateur doit utiliser un pistolet à pipette spécial pour l'opération d'ARN, et utiliser des embouts muraux, des tubes à centrifuger, des composés et des réactifs sans RNase. Tenir à l'écart ou couvrir les trous de ventilation et les fenêtres ouvertes, et utiliser les zones moins fréquentées comme zones sans RNase. Et pendant l'extraction et l'analyse de l'ARN, ne pas effectuer d'autres expériences susceptibles de provoquer une contamination par la RNase.
La méthode d'inhibition de l'activité de la RNase endogène consiste d'abord à préserver l'échantillon. Une fois le tissu prélevé, l'ARN ne doit pas être extrait directement. Au lieu de cela, il doit être rapidement congelé et stocké dans un environnement à -80 °C avec de l'azote liquide à temps, et l'expérience doit être réalisée dès que possible pour minimiser la dégradation de l'ARN.Des inhibiteurs de RNase sont ajoutés au lysat cellulaire pour briser simultanément les cellules et inactiver la RNase, minimisant ainsi l’activité de la RNase libérée lors de la rupture cellulaire. Tous les réactifs et équipements doivent être spécialement traités pour inactiver les ARNases avant utilisation.

De plus, les inhibiteurs d’ARN peuvent être utilisés pour inhiber l’activité RNase et empêcher la dégradation de l’ARN par la RNase. Il existe plusieurs types d’inhibiteurs d’ARN :

• Pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) : C'est un inhibiteur puissant mais non complet de la RNase. Il dénature la protéine par la combinaison du noyau imidazole de l'histidine dans le groupe de gènes actifs de la RNase, inhibant ainsi l'activité de l'enzyme.
• Isothiocyanate de guanidine : Actuellement considéré comme l'inhibiteur de RNase le plus efficace, il peut également inactiver la RNase lors de la lyse des tissus, ce qui peut détruire la structure cellulaire et dissocier l'acide nucléique de la nucléoprotéine, et a également un certain effet sur la RNase. Fort effet dénaturant.
• Complexe de ribonucléoside de vanadyle : complexe formé d'ions d'oxyde de vanadium et de nucléosides, qui peut se combiner avec la RNase pour former un analogue transitionnel, inhibant presque complètement l'activité de la RNase.
• Inhibiteur protéique de la RNase (RNasine) : glycoprotéine acide extraite du foie de rat ou du blastodisque humain, la RNasine est un inhibiteur non compétitif de la RNase, qui peut se lier à une variété de RNases, la rendant ainsi inactivée.
• Autres : le SDS, l’urée, la terre de diatomées, etc. ont également un certain effet inhibiteur sur la RNase.

2. Que sont les inhibiteurs de la RNase ?

Les inhibiteurs de RNase sont une classe de substances qui peuvent inhiber l'activité de la RNase. Les inhibiteurs de RNase courants comprennent le pyrocarbonate de diéthyle (DEPC), l'isothiocyanate de guanidine, les complexes ribonucléosidiques vanadyliques (RVC) et les inhibiteurs protéiques de la RNase (RNasin). Parmi eux, le DEPC et l'isothiocyanate de guanidine présentent une certaine toxicité, et le RVC a un effet inhibiteur sur la PCR polymérase, ce qui n'est pas propice aux expériences ultérieures. La RNasin n'est pas toxique et est un inhibiteur non compétitif de la RNase, qui peut se lier à diverses RNases pour les inactiver.

3. Que fait l’inhibiteur de RNase ?

Les inhibiteurs de RNase sont couramment utilisés comme mesure de précaution dans les manipulations enzymatiques de l'ARN pour inhiber et contrôler ces contaminants. La RNase est une glycoprotéine acide extraite du foie de rat ou du blastoderme humain, qui peut se lier spécifiquement à la RNase de manière non covalente pour former un complexe, provoquant l'inactivation de la RNase, protégeant ainsi l'intégrité de l'ARN. À l'heure actuelle, l'inhibiteur de RNase aide à prévenir la dégradation de l'ARN dans des applications telles que la synthèse d'ADNc, la RT-PCR, les réactions de transcription/traduction in vitro ou la purification de l'ARN.

4. Quelles sont les caractéristiques d’un inhibiteur de RNase murin ?

Les inhibiteurs de RNase murine recombinants ne contiennent pas les 2 cystéines sensibles à l'oxydation contenues dans les inhibiteurs de RNase d'origine humaine. Par conséquent, l'inhibiteur de RNase murine a une activité antioxydante élevée et est plus stable pour les expériences à faible DTT. De plus, l'inhibiteur de RNase murine de Yeasen présente les caractéristiques suivantes :
1) Inhibition globale de la RNase : l'inhibiteur de la RNase murine de YEASEN inhibe spécifiquement la RNase A, la RNase B, la RNase C, etc.
2) Conditions de réaction polyvalentes : l'inhibiteur de RNase est actif à pH 5,0-9,0 et 25℃-55℃, ce qui convient à la transcriptase inverse thermostable.
3) Plusieurs expériences en aval possibles : aucune inhibition de l'activité polymérase n'est observée lorsque l'inhibiteur de RNase est utilisé avec l'ADN polymérase Taq, la transcriptase inverse AMV ou M-MuLV ou les ARN polymérases de phage (SP6, T7 ou T3).
4) Biens fabriqués en série : une capacité de production unique de 2 milliards d’unités est utile à la gestion des coûts en garantissant l’homogénéité des produits, la stabilité de l’approvisionnement et la rapidité de livraison.
5) Cohérence d'un lot à l'autre : plate-forme d'expression et de purification de protéines matures par système de gestion de la qualité ISO13485, tests de contrôle qualité par exigences de qualité pour assurer la stabilité du produit entre les lots.

5. Produits associés et performances

A. L'inhibiteur de RNase bloque l'activité de la RNase

1 μg d'ARN total de cellules HEK, 1 μl d'inhibiteur de RNase peuvent inhiber efficacement 5 ng de RNase.

Figure 1. Effet inhibiteur de l’inhibiteur de RNase murine.

B. L'inhibiteur de RNase surpasse les produits étrangers dans les tests qPCR

L'effet inhibiteur des inhibiteurs de RNase dérivés de souris de Yeasen et R* Company (IRM) a été mesuré à l'aide de la technique qPCR dans des circonstances expérimentales identiques, et l'inhibiteur de RNase de la source murine YEASEN a efficacement inhibé la RNase A dans le système. L'effet de l'inhibition était supérieur à celui des concurrents.

Figure 2. Test d'inhibition de la RNase par IRM R*

Remarque : les courbes dans la figure de gauche à droite sont : contrôle positif (ARN uniquement, pas de RNase ni d'IRM), IRM 40 U, IRM 30 U, IRM 20 U, IRM 10 U et contrôle négatif (ARN + RNase, pas d'IRM).

Figure 3. Test d'inhibition de la RNase par IRM de Yeasen

Remarque : Les courbes dans la figure de gauche à droite sont : Contrôle positif (ARN uniquement, pas de RNase ni d'IRM), IRM 80 U, IRM 60 U, IRM 40 U, ​​IRM 30 U, IRM 20 U, IRM 10 U, Contrôle négatif (ARN+RNase, pas d'IRM).

Figure 4. Résultats de la tomodensitométrie RT-qPCR de l'IRM Yeasen et de l'IRM R*

6. Produits connexes

Les produits connexes que Yeasen peut fournir sont présentés dans le tableau 1 :

Tableau 1.Liste des produits

7. Questions fréquemment posées

Q1 : Y aura-t-il de la RNase dans l’inhibiteur de la RNase murine ?
R : Chaque réactif détectera l’activité RNase pour garantir que l’inhibiteur de RNase murine n’entraîne pas de contamination par RNase.
Q2 : Les inhibiteurs de RNase murine auront-ils un impact sur les expériences de PCR en aval ?
R : Cela n'aura aucun effet. Chaque lot d'inhibiteur de RNase murine est exempt de contamination génomique après des tests de qualité et peut être utilisé dans la recherche RT-PCR et RT-qPCR.
Q3 : L'inhibiteur de la RNase murine sera-t-il inactivé ?
R : Les inhibiteurs seront inactivés à des températures supérieures à 65 °C, et une agitation vigoureuse provoquera également l'inactivation.
Q4 : Quelles précautions faut-il prendre lors de l’utilisation d’un inhibiteur de RNase murine pour préparer le système réactionnel ?
Réponse : Lors de la préparation du système, un inhibiteur de RNase peut être ajouté en premier avant d’ajouter d’autres composants susceptibles d’introduire des sources de contamination par RNase.
Q5 : L'inhibiteur de RNase murine a-t-il une activité endonucléase et exonucléase ?
Réponse : Il n’y a pas d’activité endonucléase et exonucléase, ce qui contribue à améliorer le rendement du produit.

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