Avec le développement rapide de la biotechnologie, la thérapie par ARNm, en tant que méthode de traitement émergente, a attiré beaucoup d'attention en raison de sa forte programmabilité et de sa vitesse de réponse rapide. Dans les domaines des vaccins à ARNm et de la thérapie génique, la synthèse efficace d'ARNm de haute qualité est une étape clé pour atteindre les objectifs thérapeutiques. Au cours de ce processus, l'ARN polymérase T7 (T7 RNAP) joue un rôle essentiel, elle peut catalyser efficacement la synthèse in vitro de l'ARNm.
Bien que l'ARN polymérase T7 joue un rôle crucial dans la synthèse de l'ARNm, elle produit souvent de l'ARN double brin (ARNdb) comme sous-produit dans la pratique. L'ARNdb est l'une des caractéristiques de nombreux virus et est donc facilement reconnu par les protéines intracellulaires de liaison à l'ARNdb, déclenchant des réponses immunitaires innées et des réactions inflammatoires. Cela signifie que si les formulations d'ARNm contiennent un niveau plus élevé d'ARNdb, cela peut entraîner une activation immunitaire inutile, ce qui pourrait affecter l'efficacité thérapeutique ou provoquer des effets secondaires graves. Un excès d'ARNdb peut également interférer avec la fonction normale de l'ARNm, y compris l'efficacité de la traduction et la stabilité de l'ARNm, affectant indirectement l'efficacité de la thérapie par ARNm.
Figure 1 : L’impact des sous-produits dsRNA et de la réaction RNAP T7 optimisée.
Par conséquent, le développement et l’adoption de méthodes efficaces pour réduire la génération d’ARNdb constituent un élément crucial du développement de la technologie de l’ARNm. Les chercheurs ont mis au point diverses stratégies, notamment l’utilisation d’ARN polymérases T7 améliorées, de nucléotides de modification, l’optimisation des tampons de transcription IVT et des processus de purification en aval. Yeasen Biology utilise les capacités de sa plateforme d’évolution dirigée ZymeEditor pour faire évoluer en continu la matière première enzymatique de base pour la synthèse in vitro de l’ARNm : l’ARN polymérase T7. Nous avons développé une ARN polymérase T7 à faible teneur en dsARN qui supprime l'activité RDRP de l'ARN polymérase T7, réduisant fondamentalement la formation d'ARNdb, diminuant ainsi considérablement la teneur en dsARN.
Données du produit
Rendement : plus de 9 mg/mL
Teneur en ARNdb : la teneur en ARNdb a été considérablement réduite d'au moins 10 fois
Efficacité de bouchage : plus de 99 %
Faible taux d'ARN polymérase T7 dsRNA Processus de sélection :
1) la construction d'une bibliothèque aléatoire et d'une méthode de criblage à haut débit FADS, une bibliothèque de mutations aléatoires de plus de 10^6 a été projeté.
2) une conception semi-rationnelle et une technologie de microplaques ont été utilisées pour cribler une bibliothèque saturée en sites. Les deux méthodes ont produit des mutants d'ARN polymérase T7 à faible teneur en dsRNA. En prenant en compte la teneur en dsRNA tout en s'assurant que d'autres indicateurs ne sont pas réduits (tels que l'intégrité/l'efficacité de coiffage/le rendement, etc.), plusieurs mutants ont été sélectionnés et l’un d’eux, nommé CleaScrip™ T7, a été utilisé pour une application commerciale.
Données du produit
Dans différents scénarios d'application de longueur, l'ARN polymérase T7 à faible dsRNA a montré une diminution très significative par rapport à la T7 WT et aux produits concurrents, tout en garantissant que le rendement et l'intégrité ne sont pas réduits.
| Longueur du fragment | ARN polymérase T7 | Rendement(mg/mL） |
Intégrité(%） | Teneur en ARNdb (ng d'ARNdb produit par 1 ug d'ARN) |
| 4K | T7-WT | 12.4 | 88,3 | 0,4273 |
| CléaScrip™ T7 | 12.1 | 89,9 | 0,0129 | |
| Entreprise A | 11.0 | 87,8 | 0,0323 | |
| 9K | T7-WT | 9.5 | 81,9 | 2.9180 |
| CléaScrip™ T7 | 9.0 | 82,0 | 0,0379 | |
| Entreprise A | 7.2 | 78,7 | 0,1805 |
En utilisant Avec une concentration de 2,5 mM, une excellente efficacité de coiffage peut encore être obtenue sur différentes longueurs de fragments par rapport au WT. De plus, des performances d'expression protéique supérieures sont également observées au niveau cellulaire.
| Entrée analogique du capuchon（mM） | Efficacité du plafonnement（%）4K | |
| Poids | Faible taux d'ARNdb | |
| 10 | 100 | 100 |
| 5 | 100 | 100 |
| 2.5 | 100 | 100 |
Un brevet a été déposé aux États-Unis.
Informations sur le produit
| Nom du produit | Numéro de catalogue | Spécification | Volume |
| CleascripMT ARN polymérase T7 (faible taux d'ARNdb, 250 U/μL) | 10628ES | 100 /2500 /25 000 KU | 400 μL/10 mL/100 mL |
| CleascripMT ARN polymérase T7 de qualité GMP (faible teneur en ARNdb, 250 U/μL) | 10629ES | 100 /2500 /25 000 KU | 400 μL/10 mL/100 mL |