Figure 1 : Processus de transcription de l'ARN in vitro

Avantages du produit

Rendement élevé : peut produire jusqu'à 200 μg en 2 heures grâce à une réaction de transcription

Meilleure polyvalence : convient à la transcription d'ARN de 20 à 10 000 nt

Excellentes performances : réduire efficacement les sous-produits de la transcription pendant le processus IVT

Applications multiples : peut être utilisé pour la synthèse d'ARN ordinaire, marqué et modifié

Propriétés du produit

Figure 2 : Rendement des transcriptions de différentes longueurs

Figure 3 : Qualité des transcriptions de différentes longueurs

Figure 4 : Expression de transcrit ARNm dans HEK-293 cellules

Remarque : l’ARNm a été coiffé avec l’enzyme de coiffage Vaccinia (Yeasen#10614/10615).

Méthodes expérimentales

Réactifs de décongélation

Centrifuger brièvement le mélange d'ARN polymérase T7 et placer il sur glace. Décongeler 10×Tampon de transcription et ribonucléotidem (ATP, CTP, GTP, UTP), mélanger et centrifuger au fond du tube, placer le tampon de transcription 10× à température ambiante et placer 4 types de ribonucléotides sur de la glace.

B.Réaction d'assemblage-transcription à température ambiante

Préparez le système réactionnel selon le système suivant :

Composants	Volume (µL)	Concentration finale
H sans RNase2O	Jusqu'à 20	-
Tampon de transcription 10×	2	1×
CTP / GTP / ATP / UTP (100 mM chacun)	2 chacun	10 mM chacun
Modèle ADN	1 µg	-
Mélange d'ARN polymérase T7	2	-

Remarques :

1. La réaction est configurée à température ambiante. Étant donné que le tampon de transcription 10× contient de la spermidine, la concentration élevée de spermidine peut provoquer une précipitation de la matrice d'ADN à basse température.
   Pour les transcriptions courtes (< 100 nt), un modèle de 2 µg peut être utilisé, le temps de transcription étant étendu à 4-8 heures.
   3. Pour les transcriptions longues (> 1000 nt), il est recommandé d'utiliser des plasmides linéarisés comme modèles pour la transcription.
   4. Effectuez la réaction dans l’instrument PCR avec le couvercle chaud ouvert pour éviter l’évaporation.
   5. Le produit de réaction peut avoir un précipité blanc. Le précipité est le pyrophosphate de magnésium produit par les ions pyrophosphate et magnésium libres dans la solution réactionnelle n'ont pas d'incidence sur les expériences ultérieures. Si vous souhaitez les éliminer, vous pouvez ajouter de l'EDTA. Si l'ajout d'EDTA affecte les expériences ultérieures, le surnageant peut également être récupéré par centrifugation.
   6. Conservez les réactifs et les conteneurs sans contamination par la RNase.

C. Incuber à 37°C pendant 2 heures

Mélanger les composants de la solution, centrifuger brièvement jusqu'au fond du tube et incuber à 37°C pendant 2 heures. Si la longueur de la transcription est inférieure à 100 nt, prolonger le temps de réaction à 4-8 heures.

Traitement D.DNase I (optionnel)

Une fois la réaction terminée, ajoutez 2 μL de DNase I (sans RNase) à chaque tube et incubez à 37 °C pendant 15 minutes pour éliminer l'ADN matrice.

Questions fréquemment posées

1. Faible rendement de transcription

La qualité du modèle est étroitement liée au rendement. Le rendement du groupe expérimental est significativement inférieur à celui du groupe témoin. Les raisons possibles sont les suivantes :

• Le modèle expérimental contient des composants inhibiteurs ;
• Il se peut que le modèle présente un problème.

Suggestions : ① Re-purifier le modèle ; ② Déterminer la quantification du modèle et son intégrité ; ③ Prolonger le temps de réaction ; ④ Augmenter la quantité de modèle d'entrée ; ⑤ Utiliser d'autres promoteurs et autres ARN polymérases.

2. Faible rendement des transcriptions courtes

Les fragments de matrice courts peuvent inhiber la réaction. Lorsque le produit de transcription est inférieur à 100 nt, si vous souhaitez augmenter le rendement, prolongez le temps de réaction à 4-8 heures ou augmentez la quantité de matrice à 2 μg.

3. La longueur de la transcription de l'ARN est plus grand que prévu

Si le résultat de l'électrophorèse montre que la bande de produit est plus grande que la taille attendue, les raisons possibles peuvent être : ① Le modèle plasmidique n'est peut-être pas complètement linéarisé ; ② L'extrémité 3' du brin sens a une structure proéminente ; ③ L'ARN a une structure secondaire qui n'est pas complètement dénaturée.

Suggestions : ①Vérifiez si le modèle est complètement linéarisé et, si nécessaire, effectuez une linéarisation supplémentaire ; ②Sélectionnez une enzyme de restriction appropriée pour éviter les surplombs 3' ou utilisez l'ADN polymérase Klenow Fragment/T4 pour terminer la transcription avant de continuer ; ③Utilisez un gel dénaturé pour détecter les produits d'ARN.

4. La longueur de la transcription de l'ARN est plus petit que prévu

Si l'électrophorèse montre que la bande de produit est plus petite que la taille attendue, les raisons possibles sont : ①Le modèle contient une séquence de terminaison similaire au terminateur de l'ARN polymérase T7 ; ②Le contenu en GC de le modèle est trop haut.

Suggestions : ①Abaisser la température de réaction (par exemple, 30°C). Parfois, l'abaissement de la température peut contribuer à allonger la longueur de la transcription, mais cela peut réduire le rendement. Essayez d'autres ARN polymérases pour la transcription ; ②Si la teneur en GC du modèle est élevée, effectuez la réaction à 42℃ ou ajoutez du SSB pour augmenter le rendement et la longueur de la transcription.

5. Élimination électrophorétique des produits transcriptionnels

La formation de traînées pendant l'électrophorèse peut être causée par : ① Contamination par la RNase au cours de l’opération expérimentale ; ②Le modèle d’ADN est contaminé par des ARNases.

Suggestions : ①Utilisez des pointes de pipette et des tubes EP sans RNase, portez des gants et des masques en latex jetables et tous les réactifs sont préparés avec de l'H sans RNase₂O. ②Re-purifier l’ADN modèle.

Informations de commande

Nom du produit	Numéro de catalogue	Sspécification
Kit de synthèse d'ARN à haut rendement T7	10623ES	50/100/500 T
ARN polymérase T7 de qualité GMP (250 U/μL)	10625ES	10KU/100KU/2500KU/25MU
Pyrophosphatase inorganique de qualité GMP (1 U/μL)	10620ES	10U/100U/1000U
Inhibiteur de RNase murine de qualité GMP (40 U/μL)	10621ES	10KU/20KU/100KU/1MU
Enzyme de coiffage de l'ARNm de la vaccine de qualité GMP	10614ES	2KU/10KU/100KU
Capuchon d'ARNm 2'-O-méthyltransférase de qualité GMP	10612ES	10 KU/50 KU/250 KU
Désoxyribonucléase I (DNase I) de qualité GMP	10611ES	500/2000/10000 U
Kit maître d'isolement d'ARNm Hieff NGS®	12603ES	24/96 T