Cet article décrit l'application de la Concanavaline A et son couplage covalent avec des billes magnétiques.
Partie 1. Concanavaline A
Les billes magnétiques recouvertes de concanavaline A (billes ConA), comme leur nom l'indique, sont des billes biomagnétiques dans lesquelles la lectine végétale Concanavaline A (ConA) est couplée à des nanomatériaux superparamagnétiques. Voici une brève introduction aux billes magnétiques ConA.
La concanavaline A (ConA), une protéine lectine végétale sans spécificité de groupe sanguin, a été la première protéine lectine végétale à être isolée, purifiée et cristallisée à partir de la seiche (Canavalia ensiformis, Pennisetum maritimum) depuis 1936.
ConA a 2 formes principales selon le pH de la solution dans laquelle il est présent : l'homodimère α-2 ou l'homotétramère α-4 [2]Dans des conditions alcalines (pH> 7,0), il existe sous forme de tétramère (constitué de quatre sous-unités de poids moléculaire de 26 kDa) ; dans des conditions acides (pH 4,5-5,5), Con A se dissocie en une structure dimérique activée (52 kDa). De plus, la fonction de ConA est affectée par les cations divalents, par exemple en l'absence d'ions métalliques (Ca2+ et Mn2+), sa conformation et sa fonction de liaison aux glycoprotéines ne peuvent pas être réalisées[1].
Fig. (1). Modélisation moléculaire du (A) monomère ConA, (B) dimère ConA, (C) tétramère ConA avec du mannose, du glucose et des ions métalliques.
Partie 2. Perles
Les billes biomagnétiques sont une classe de microsphères magnétiques de taille nanométrique, formées de polymères et de nanoparticules magnétiques inorganiques. Les billes magnétiques peuvent être classées en trois catégories principales selon leur structure : structure de type noyau-coquille, structure de type sandwich et structure de type diffus. Les matériaux magnétiques comprennent la poudre de fer pur, le fer carbonyle, le minerai magnétique, l'orthoferrite et l'alliage fer-cobalt. et al.
Les nanomatériaux magnétiques, en raison de leurs effets spéciaux, tels que l'effet de petite taille, l'effet de surface et l'effet de taille quantique, etc., dans la taille du Fe3O4 Les nanoparticules sont de taille inférieure à 30 nm, l'interférence de la perturbation thermique à l'intérieur des nanoparticules est importante et, à ce stade, ces nanoparticules présentent une propriété magnétique particulière, à savoir le superparamagnétisme.3O4 Les nanoparticules sont largement utilisées dans l'industrie biologique en raison de leurs propriétés de haute qualité, telles que la non-toxicité, la bonne biocompatibilité, les propriétés de ciblage magnétique uniques et la facilité de génération de chaleur dans les champs magnétiques alternatifs.
En revanche, le couplage covalent de ConA avec des microsphères pour l'immobilisation de biomolécules présente les avantages suivants :
- Haute stabilité de la liaison de couplage covalent pour la reproductibilité ;
- Liaison du ligand ConA à la surface des microbilles pour les interactions avec les molécules cibles ;
- Caractérisation cinétique de l’environnement de la solution, adaptée à la manipulation expérimentale biologique ;
Partie 3. Application des billes magnétiques ConA
Comme indiqué dans la littérature, les principales applications des billes magnétiques ConA sont classées en 3 scénarios, qui consistent à effectuer la séparation de la membrane cytoplasmique, l'enrichissement des glycoprotéines et la séparation des aspects cellulaires immobilisés.
Application I : Séparation des membranes cytoplasmiques
En utilisant des billes magnétiques ConA affectées par l'activation de cations divalents, de sorte qu'elles existent dans Ca2+ et Mg2+ Les environnements de solution, qui possèdent la fonction d'interaction d'affinité de l'α-D-mannosyle terminal et de l'α-D-glucosyle, utilisés dans la purification de la membrane plasmique, constituent un moyen simple et efficace. Par exemple, la séparation de la membrane plasmique des cellules ou des tissus est une étape clé pour obtenir des protéines de la membrane plasmique. ConA est capable de lier les protéines glycosylées sur les cellules, et ce principe peut être utilisé pour obtenir une membrane plasmique de plus grande pureté. Les principales étapes de l'opération sont : l'immobilisation de ConA sur des billes magnétiques en liant ConA biotinylé à des billes magnétiques de streptavidine ; l'incubation des membranes cellulaires avec des billes magnétiques ConA pendant 1 h ; l'adsorption sur un support magnétique ; le lavage avec TBS pendant 5 fois ; et l'élution de la solution de membrane cytoplasmique avec l'éluant[3].
Fig 2. Étapes de purification des billes magnétiques ConA pour la membrane plasmique
Application II : Enrichissement en glycoprotéines
ConA est spécifique du mannose et du glucose et reconnaît le mannose α-conjugué, qui se trouve être l'« oligosaccharide central » de nombreuses glycoprotéines sériques et membranaires cellulaires. Par conséquent, il peut être utilisé en immunologie pour séparer les molécules glycosylées telles que les glycoprotéines dans les lysats cellulaires ou tissulaires ou dans le sérum.
Une procédure majeure consistait à par réticulation de nanoperles magnétiques aminosilanisées (MNP) avec ConA via un lieur bifonctionnel, le linoléate de bis-N-hydroxysuccinimide (DSS), pour obtenir des billes magnétiques ConA ; pour terminer la liaison non spécifique des nanoperles magnétiques en utilisant du méthoxyéthylène glycol (MEG), et pour effectuer la séparation magnétique ; pour ajouter l'extrait des protéines de membrane cellulaire digérées avec de la trypsine pour incuber à la fois les billes magnétiques ConA et les glycopeptides capturés, et enfin pour éluer les glycopeptides capturés, et pour effectuer un séchage sous vide. Les billes magnétiques ConA ont été toutes deux incubées, les billes magnétiques ConA qui avaient des glycoprotéines liées ont été collectées par le support magnétique, les non-glycopeptides ont été lavés, et enfin les glycopeptides capturés ont été élués et séchés sous vide. Cette méthode permet une analyse approfondie des sites de glycosylation spécifiques des protéines associées aux tumeurs (par exemple, EGFR)[4].
Fig 3. Nanoparticules superparamagnétiques couplées à différentes lectines
Application III : Isolement des cellules immobilisées
L'utilisation de billes magnétiques ConA (billes magnétiques liées de manière covalente à la concanavaline A de haute pureté) pour se lier aux glycoprotéines des membranes cellulaires ou nucléaires, capturant ainsi les cellules ou les noyaux, permet de visualiser la manipulation expérimentale d'un petit nombre de cellules. Par exemple, les billes magnétiques ConA sont utilisées dans CUT&Tag et CUT&RUN [5] expériences, qui sont de nouvelles techniques utilisées pour étudier la structure et la fonction de la chromatine, et sont immobilisées en liant des billes magnétiques ConA aux cellules pour visualiser l'opération et éviter le problème de perte de cellules causé par la centrifugation.
Par rapport à la technologie traditionnelle ChIP-seq pour l'étude des interactions ADN-protéines, CUT&Tag et CUT&RUN présentent les avantages suivants :
- Les billes magnétiques ConA se lient aux glycoprotéines de la membrane cellulaire pour visualiser l'opération et améliorer l'expérience de l'opération expérimentale ;
- Pas besoin de centrifugation, juste des billes magnétiques ConA adsorbées sur le support magnétique pour compléter la séparation des échantillons de cellules et des solutions ;
- Peut être utilisé avec seulement 10 cellules, évitant ainsi le besoin d'un grand nombre d'échantillons pour ChIP-seq.
Fig 4. Diagramme schématique du déroulement des expériences ChIP-seq, CUT&Tag, CUT RUN
Partie 4. Billes magnétiques recouvertes de concanavaline A YEASEN
Les billes magnétiques ConA, développées par YEASEN, sont capables de se lier aux glycoprotéines, glycolipides, polysaccharides et autres molécules avec modification de glycosylation de manière rapide, efficace, sensible et spécifique après une sélection rigoureuse des matières premières et une optimisation et une amélioration multiples des processus. Elles sont principalement utilisées pour l'isolement cellulaire ou pour l'isolement de molécules glycosylées telles que les glycoprotéines dans les lysats cellulaires ou tissulaires ou le sérum, et sont particulièrement utilisées directement pour des expériences telles que CUT & RUN et CUT&Tag (une technologie innovante pour les expériences ChIP-seq).
1.Caractéristiques du produit
- Production par lots stable et meilleure reproductibilité des résultats ;
- Stockage de performances stables
- Efficacité de capture cellulaire > 90 %
2. Informations sur le produit
| N° de chat. | Numéro de référence 19810ES |
| Taille | 1 ml/5 ml/20 ml |
| Couleur | Jaune brunâtre |
| Concentration des billes | 10 mg/mL |
| Contenu solide | 9-11 mg/mL |
| Taille des billes | 1 µm |
| Capacité | 105 cellules/billes µL |
3. Données sur les performances du produit
(1)Monodispersité
Dans les mêmes conditions de traitement et sous un grossissement de 10×/40×, les billes ConA étaient essentiellement monodispersées et aucune agglomération évidente n'a été observée par rapport au concurrent.
| Perles de matières premières YEASEN | Perles concurrentes ConA | Perles YEASEN ConA (Cat#19810) |
Fig. 5. Graphique des résultats de monodispersité
(2) Effet de la liaison des billes ConA sur les cellules
Le même nombre de cellules a été incubé avec les billes pendant la même durée, et le nombre de cellules restantes après la conjugaison des billes ConA a été automatiquement détecté sous l'analyseur de cellules, et les résultats ont montré que le YEASEN Les billes ConA (Cat#19810) ont surpassé les produits concurrents.
| Suspension cellulaire | Cellules restantes après la liaison de billes magnétiques compétitives ConA | Cellules restantes après la liaison de YEASEN Perles magnétiques ConA |
Fig. 6.Image de cellules liées à des billes magnétiques ConA
(3)Nombre et répétabilité de liaisons cellulaires
Les deux YEASEN 10µL Les billes ConA (Cat#19810) et les billes ConA concurrentes de 10 µL lient un nombre de cellules de niveau E7 comparable à celui du concurrent. La capture cellulaire était supérieure à 90 % lors d'opérations répétées.
Fig. 7. Les résultats du nombre de cellules de liaison et du taux de capture des billes ConA
(4) Stabilité d'accélération
Distribuer à raison de 1 ml/tube. Les conditions de stockage étaient les suivantes : traitement accéléré à 4 °C, 37 °C pendant 2, 4, 7, 11 et 14 jours, et traitement de destruction à -20 °C pendant 1, 3, 6 et 8 jours. Les résultats ont montré que dans les mêmes conditions expérimentales : le taux de capture cellulaire des produits stockés à 4 °C, le traitement accéléré à 37 °C et le traitement de destruction à -20 °C était > 95 %, et la valeur CV des trois groupes de réplicats dans chaque condition de traitement était inférieure à 1 %, ce qui a montré une bonne reproductibilité.
Fig 8. Les résultats du taux de capture cellulaire et du biais de répétabilité des billes ConA sous différentes températures et durées
Informations de commande
| 19810ES |