Différents types de billes magnétiques en NGS : billes magnétiques ADN\ARN\ARNm
Les billes magnétiques sont l'un des produits nécessaires à la construction de bibliothèques de séquençage à haut débit. Elles peuvent purifier l'ADN ou l'ARN, filtrer les fragments d'ADN de taille cible et enrichir les acides nucléiques cibles. Avec le développement de la technologie de séquençage, des billes magnétiques spécialisées dans différents domaines d'application ont vu le jour, notamment les billes magnétiques de purification de l'ADN, les billes magnétiques de sélection de la taille de l'ADN, les billes magnétiques de purification de l'ARN et les billes magnétiques d'enrichissement de l'ARNm. Alors, quels sont les principes des différentes billes magnétiques ? Comment choisir ?
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1. Billes d'ADN
2. Présentation des billes d'ADN en forme d'étoile
3. Billes de purification d'ARN
4. Billes magnétiques enrichies en ARNm
5. Recommandation de produit pour les billes magnétiques Yeasen
1. ADN Perles
1.1 Principes de base
Le principe de purification de l'acide nucléique par billes magnétiques repose sur l'immobilisation réversible en phase solide (SPRI). Dans certaines conditions, l'acide nucléique se lie sélectivement aux billes magnétiques, tandis que les polluants restent dans la solution. Après application d'un champ magnétique, les billes magnétiques se liant aux molécules cibles sont séparées de la solution, puis les billes magnétiques sont nettoyées pour éliminer davantage les polluants. Étant donné que la combinaison des billes magnétiques et des molécules d'acide nucléique est réversible, l'acide nucléique peut être élué des billes magnétiques avec un tampon à faible teneur en sel.
La surface extérieure des billes magnétiques est modifiée avec des groupes fonctionnels hydroxyle ou carboxyle de silicium. Dans le système tampon de purification contenant du PEG et des ions salins élevés, l'ADN est lié aux billes en formant un pont ionique du groupe carboxyle des ions salins de l'ADN. Cette liaison est réversible. Le pont ionique est éliminé dans le tampon TE sans PEG ni ions salins, et enfin, l'ADN est purifié. Sur la base des billes magnétiques carboxyles, différentes entrées de billes magnétiques et tampons de purification lieront différentes tailles de fragments. Les billes magnétiques se lient préférentiellement aux gros fragments d'ADN, donc dans le premier tour, les billes magnétiques sont utilisées pour lier les fragments plus gros que le fragment cible, et le surnageant est conservé ; dans le deuxième tour, les billes magnétiques se lient au fragment cible dans le surnageant puis éliminent le surnageant ; enfin, le fragment cible est élué des billes magnétiques, dont les fragments d'ADN sont de la taille cible.
Figure 1. Structure de billes magnétiques carboxyles
Figure 2. Principe de la purification de l'ADN par billes magnétiques
1.2 Processus d'opération
Figure 3. Étapes de purification de l'ADN
Figure 4. Étapes de sélection de la taille de l'ADN
1.3 Conseils d'utilisation des billes magnétiques
Rendement amélioré et sélection précise de la taille
(1) Bien mélanger avant utilisation et équilibrer les billes magnétiques à température ambiante pendant au moins 30 min.
——La solubilité du PEG dans les billes magnétiques le tampon est facilement affecté par le pH et la température.Avant utilisation, il est nécessaire d'équilibrer à température ambiante pour faire les billes magnétiques sont uniformément suspendues et le PEG est complètement dissous pour éviter d'affecter les effets d'adsorption et de séparation
(2) Le temps d'adsorption doit être suffisant et complètement mélangé pour rendre l’adsorption adéquate ;
(3) Lavage à l’éthanol à 80 % lors de la purification ou de la séparation ;
——Sous 80 % d'éthanol, l'acide nucléique est déshydraté et rassemblé étroitement et ne se dissout pas. Les enzymes résiduelles, les tampons, les impuretés, etc. dans le système sont nettoyés avec de l'éthanol pour obtenir un produit plus pur bibliothèque.
(4) Lors de la sélection de la taille, confirmez le volume de l’échantillon pour vous assurer que le rapport d’ajout de billes magnétiques est correct ;
——Lors de la sélection de la taille, il est nécessaire de saisir avec précision le volume correspondant de billes magnétiques, afin que la proportion soit précise, car le changement de concentration en PEG et en ions sel dans le tampon peut affecter les résultats.
(5) Avant l’étape d’élution, laissez l’alcool se volatiliser complètement, mais empêcher les perles de séchage excessif
——En général, il peut être séché en 2 à 3 minutes. Lorsque le nombre de billes magnétiques est important et difficile à sécher, Il est recommandé d'opérer dans plusieurs tubes à centrifuger.
(6) Si les billes magnétiques sont agglomérées ou en plaques, le temps d'élution peut être étendu après avoir complètement mélangé ;
——Cela peut être causé par impuretés dans l'ADN ou temps de séchage trop long. Généralement, lorsqu'il y a beaucoup d'impuretés dans l'ADN, il est recommandé de le purifier au préalable avant sélection de taille.
2. Présentation des billes d'ADN en forme d'étoile
Les billes de sélection d'ADN Hieff NGS™ sont basées sur le principe SPRI (immobilisation inverse en phase solide), utilisant des matières premières de billes magnétiques importées et un système tampon optimisé, qui peuvent être utilisées pour la sélection et la purification de la taille des fragments d'ADN lors de la construction de la bibliothèque NGS. Elles sont utilisées de la même manière que les billes AMPure XP utilisées, et l'efficacité de récupération des fragments et la distribution de la taille de la bibliothèque sont très cohérentes avec elles.
2.1 Introduction aux performances de purification
- Système tampon unique : fragments d'ADN jusqu'à 50 pb peuvent être récupérés.
- Taux de récupération élevé : ≥ 90 %.
- Élimine efficacement les impuretés : Élimine efficacement les impuretés telles que le dimère d'amorce, le dNTP, le sel inorganique et les protéines.
- Large gamme d'applications : convient à la purification de l'ADN dans des scénarios tels que la digestion enzymatique, la ligature, le clonage et la création de bibliothèques NGS.
Tableau 1. Efficacité de purification et de récupération de l'ADN par billes magnétiques avec différents ratios
| Groupe d'expérience | Concentration de récupération des billes magnétiques dans ce lot (ng/μL) | Taux de récupération | Groupe de billes AMPure XP (ng/μl) ④ | Taux de récupération | CV% | |||
| Rapport | ① | ② | ③ | Moyenne | ||||
| 1,8 × | 22.2 | 23.4 | 22,8 | 22.8 | 96,92% | 22.2 | 94,37% | 2,55% |
| 0,8× | 20.2 | 19.3 | 18,5 | 19.33 | 82,19% | 17.8 | 75,67% | 6,52% |
| 0,6× | 16.3 | 17.3 | 16.8 | 16.8 | 71,42% | 16.2 | 68,87% | 2,55% |
Figure 5. Effet de purification des résultats de l'électrophorèse sur gel d'agarose à billes magnétiques
M : échelle d’ADN de 1 kb ;
2.2 Performances de sélection de taille
- Facile à fonctionnement : le principe de séparation et le fonctionnement expérimental sont tout à fait cohérents avec les billes magnétiques XP
- Sélection de taille précise : la taille des fragments triés est précise et stable
- Large applicabilité : convient pour bâtiment Bibliothèques d'ADN et d'ARN et adaptation pour la sélection de la taille des fragments de divers types d'échantillons
- Performances de coût ultra élevées : qualité stable, prix plus économique, service avant-vente et après-vente plus attentionné
Figure 6. Résultats de la sélection de la taille de l'ADN
3. Billes de purification d'ARN
Le nettoyeur d'ARN Hieff NGS™ est basé sur le principe SPRI, qui peut éliminer efficacement les protéines, les ions salins et autres impuretés pour obtenir des échantillons d'ARN concentrés de haute pureté et optimiser soigneusement le système tampon acide pour maintenir la stabilité de la structure de l'ARN et empêcher la dégradation de l'ARN. Il convient à la construction de bibliothèques d'ARN, à la purification d'échantillons d'ARN totaux après élimination de l'ARNr, à la purification de produits d'ARN transcrits in vitro, à la purification de produits marqués à l'ARN, à la purification d'ARN synthétique, etc.
- Haute qualité: matières premières importées, qualité très stable
- Système tampon optimisé : assure la pureté et l'intégrité de l'ARN et prévient efficacement la dégradation de l'ARN
- Haute efficacité : récupération efficace, adaptée à la construction de bibliothèques d'ARN ou in vitro récupération de produits de transcription, etc.
Figure 7. Électrophorégramme de différents échantillons après purification
4. Billes magnétiques enrichies en ARNm
4.1 Principe d'isolement de l'ARNm
Les billes magnétiques de séparation et d'enrichissement d'ARNm sont des billes magnétiques dont la surface est modifiée avec un oligo (dT). Grâce au principe d'hybridation, elles peuvent lier spécifiquement l'ARNm avec la queue Poly A et séparer spécifiquement l'ARNm de l'ARN total ou des cellules tissulaires. Ce kit avec la formule de produit optimisée peut isoler efficacement l'ARNm complet de haute pureté de l'ARN des cellules et des tissus d'animaux, de plantes, d'insectes et de micro-organismes eucaryotes.
Figure 8.principe d'enrichissement et de purification des billes magnétiques d'ARNm
4.2 Performances des billes d'isolement d'ARNm
Le kit d'isolement d'ARNm Hieff NGS™ est développé indépendamment par Yeasen pour l'isolement d'ARNm à partir d'ARN total. Les billes de capture d'ARNm sont des microsphères paramagnétiques de la taille d'un micron modifiées avec un oligo (dT). En se combinant avec l'ARNm à queue poly (A), l'ARNm est isolé et purifié à partir de 10 ng-4 μg d'ARN total avec une bonne intégrité.
- Haute efficacité : la purification de l'ARNm peut être réalisée en 45 minutes
- Haute pureté : Les billes magnétiques oligo (dT) se lient spécifiquement à l'ARNm
- Fiable: l'ARNm obtenu est adapté au NGS, in vitro Traduction, RT-PCR et synthèse d'ADNc
Figure 9. Kit d'isolement d'ARNm pour la purification d'ARNm à partir de différents échantillons d'ARN
Remarque : le rendement des gènes domestiques représente l’effet de la récupération de l’ARNm. Rendement des gènes liés à l’ARNr caractérisation de l'efficacité d'élimination de l'ARNr
4.3 FAQ sur les billes magnétiques d'ARNm
(1) Pourquoi les billes magnétiques s'agglomèrent et comment résoudre ce problème ?
——Perles magnétiques L'agglomération réduira le rendement et la pureté de l'ARNm. L'échantillon peut contenir de nombreuses impuretés, telles que des polysaccharides, des protéines et de l'ADN à longue chaîne. Ces impuretés conduiront à des billes magnétiques agglomération. La solution consiste à souffler les billes magnétiques à travers une pipette. L'ADN génomique peut être éliminé par traitement à la DNase avant purification. Si la taille initiale de l'échantillon est trop grande et dépasse la charge des billes magnétiques, celles-ci s'aggloméreront également. Il est recommandé d'opérer selon la quantité saisie dans le manuel.
(2) Pourquoi le rendement en ARNm est-il faible ?
——Il existe de nombreuses raisons expliquant le faible rendement en ARNm :
- Le niveau d’expression de l’ARNm des cellules ou des tissus est faible, nous pouvons donc sélectionner les échantillons de période d’expression appropriés ou augmenter de manière appropriée la quantité totale d’ARN d’entrée de l’échantillon.
- Le rapport billes magnétiques/échantillons est trop faible, ce qui affecte la combinaison de l'ARNm et des billes magnétiques. Essayez d'augmenter le nombre de billes magnétiques ou réduire la quantité et le volume d'échantillon d'entrée.
- Le temps d’hybridation est trop court, le temps d’incubation peut être augmenté à 10-15 min ;
- L'élution est insuffisante, il est nécessaire d'augmenter de manière appropriée le volume du tampon d'élution, d'augmenter le temps et la température d'élution, ou de répéter l'étape d'élution deux fois.
(3) Comment éliminer efficacement l’ARNr ?
——Si l'opération est incorrecte, l'ARNr sera lié de manière non spécifique aux billes magnétiques avec l'ARNm pendant la purification, surtout lorsqu'il y a une grande quantité d'ARN total entrant. Deux cycles de liaison sont généralement utilisés dans le processus de purification pour éviter efficacement la pollution par l’ARNr. Assurez-vous qu'il est complètement mélangé pendant l'expérience de lavage pour éliminer la liaison non spécifique et essayer d'éliminer la pollution par l'ARNr.
(4) Pour de nombreuses applications en aval, est-il nécessaire d’éluer l’ARNm et les billes magnétiques interféreront-elles avec les réactions enzymatiques en aval ?
——Certaines réactions en aval peuvent être réalisées directement avec des billes magnétiques sans éluer les ARNm, telles que la fragmentation de l’ARNm et la transcription inverse dans la construction d’une bibliothèque d’ARN.Cependant, si des réactions de PCR doivent être réalisées, il est nécessaire de s'assurer qu'il n'y a pas de pollution de l'ADN génomique, sinon de nombreux fragments d'amplification génomique seront générés, ce qui interférera avec les résultats expérimentaux. Des opérations détaillées peuvent être réalisées selon les instructions des réactions en aval correspondantes, telles que la construction d'une bibliothèque RNA-Seq
(5) Le kit peut-il séparer l’ARNm directement des cellules ou des tissus ?
——Je ne recommande pas ! Le lysat contient certains composants qui vont affecter la liaison de l'ARNm. Il est recommandé d'utiliser un kit spécial.
5. Recommandation de produit pour les billes magnétiques Yeasen
Les billes magnétiques de la série Hieff NGS™, en tant que produits phares de Yeasen, présentent d'excellentes performances et une capacité de production élevée pour répondre à diverses applications et remplacer sans problème les billes Beckman AMPure XP. Depuis son lancement en 2018, les billes magnétiques Yeasen ont acquis une bonne réputation dans l'industrie et les ventes n'ont cessé d'augmenter. Elles constituent le meilleur choix pour une bonne qualité et un prix bas.
Tableau 2. Recommandation de produit pour les billes magnétiques Yeasen
| Nom du produit | Chat# | Spécification | Scénarios d'utilisation et d'application |
| Système de surveillance de la glycémie haute performance (NGS) de Hieff Billes de sélection d'ADN | 12601ES03 | 1 ml | 👉ADN NGS purification et sélection de taille 👉Purification des produits PCR 👉Purification des produits de digestion et de ligature enzymatiques |
| 12601ES08 | 5 ml | ||
| 12601ES56 | 60 ml | ||
| 12601ES75 | 450 ml | ||
| Système de surveillance de la glycémie haute performance (NGS) de Hieff Nettoyeur d'ARN | 12602ES03 | 1 ml | 👉Purification de l'ARN 👉Purification des échantillons d'ARN total après élimination de l'ARNr 👉Purification des produits marqués à l'ARN |
| 12602ES08 | 5 ml | ||
| 12602ES56 | 60 ml | ||
| 12602ES75 | 450 ml | ||
| Kit maître d'isolement d'ARNm Hieff NGS™ | 12603ES24 | 24 T | 👉Isolement et purification de l'ARNm 👉Purification de l'ARNm par transcription in vitro |
| 12603ES96 | 96 T |
Concernant la lecture
Que savez-vous de la technologie liée au NGS ?
5 minutes pour comprendre le passé et le présent des billes de sélection d'ADN (y compris l'analyse des résultats et l'interprétation des FAQ)